Xác định hoạt tính của enzyme bằng cách nào

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME BROMELIN

1. Nguyên tắc

   Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzyme Bromelin có trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid trichloracetic. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrosin để tính lượng sản phẩm do enzyme xúc tác tạo nên.

2. Dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ

Ống nghiệm

Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml

Máy quang phổ

Becher 50ml, 250ml, 500ml

Bình tia

               Hóa chất

Dung dịch Casein 1%

Dung dịch TCA 5%

Dung dịch NaOH 0,5N

Thuốc thử Folin

Dung dịch HCl 0,2N

Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 mM/ trong dung dịch HCl 0,2N

3. Chuẩn bị đường chuẩn Tyrosin

Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin

Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODTK).

4. Cách tiến hành

           Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử không

Các bước chuẩn bị mẫu enzyme để đo hoạt tính

            Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử thật và cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không.

Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm. Tính ΔOD = ODTT – ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra được số µM Tyrosin.

5. Tính kết quả

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm (35,50C: pH 7,6 …) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1µM Tyrosin trong đường chuẩn.

Hđ Protease  =(µM Tyrosin * V*L)/ (t*m*v)     (UI/g)

 Với:  Hđ Protease: hoạt độ enzyme protease (UI/g)

  V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml)

  v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)

  t : thời gian thủy phân (phút)

  m : khối lượng mẫu enzyme đem đi xác định hoạt tính (g)

  L: độ pha loãng enzyme               

  µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn 

b. Bên cạnh pH và nhiệt độ, cũng cần lưu ý đến cơ chất , thành phần đệm, lực ionhay nồng độ muối , các chất làm bền như Ca2+, glycerol, albumin huyết thanh bò(BSA) hay một số chất khác . Sự có mặt của NaCl hay KCl ở nồng độ vài chụcmilimol/l trong đệm phân tích là không ảnh hưởng đến hầu hết hoạt độ của các loạienzyme, thậm chí rất cần thiết với một số enzyme. Tuy vậy có một số enzyme lại nhạycảm với NaCl nhưng không phải với KCl , hoặc ngược lại . Việc bổ sung Ca 2+ là cầnthiết cho việc làm bền nhiều enzyme, nhất là các enzyme proteolytic hay amylolytic.c. Các phân tích hoạt độ enzyme phải thực hiện ở mộ t giá trị pH ổn định , vì vậyphải dùng một loại dung dịch đệm hay một hệ thống đệm nào đó. Nồng độ đệmthường dùng là 20÷50 mM. Tuy vậy với các phản ứng sinh acid , base (ví dụ nhưenzyme Urease) thì phải dùng đệm ở nồng độ cao hơn để tránh sự thay đổi pH trongqúa trình phân tích. Một số đệm (như đệm Phosphate) có thể làm kết tủa một số yếu tốcần thiết cho hoạt động của enzyme như Ca2+, Zn2+, vì vậy phải lựa chọn loại đệmthích hợp cho phân tích.d. Trong phân tích hoạt độ enzyme, cơ chất và sản phẩm , đệm đều phải có cùngnhiệt độ khi phân tích , khi tiếp xúc với nhau để bắt đầu phản ứng . Với các phân tíc hđồng thời nhiều mẫu , thời gian bắt đầu và kết thúc phản ứng của tất cả các mẫu phảiđược duy trì như nhau.e. Phải luôn luôn có mẫu kiểm tra thích hợp để tránh sai số . Ví dụ để xác địnhhoạt độ của proteolytic của một mẫu dịch chiết nào đó thông qua việc đánh giá mức độthủy phân casein và sau đó xác định mức độ thủy phân cơ chất nhờ vào tính chất hấpthụ ánh sáng ở bước sóng 280nm (A280) của các amino acid thơm tạo thành . Trong thínghiệm này, lượng amino acid thơm cũng có thể có mặt trong chính dịch chiết hay cómặt ngay trong dung dịch cơ chất ban đầu . Thậm chí, đệm phân tích cũng có thể tạo rasố đọc nhất định ở bước sóng 280 nm. Khi đó cách đánh giá chỉ có thể thực hiện đượckhi có mẫu kiểm tra với enzyme được bất hoạt trước khi được cho tác dụng với cơchất. Hiệu số đọc A280 giữa mẫu thí nghiệm và kiểm tra phản ánh hoạt độ enzyme.f. Phải lựa chọn phương pháp làm ngừng phản ứng thích hợp . Trong một sốtrường hợp , các làm ngừng phản ứng enzyme có thể làm biến đổi cơ chất hay phảnứng cần đo . Ví dụ việc bổ sung acid sẽ làm phân hủy NADH /NADPH, hay việc bổsung kiềm sẽ làm phân hủy NAD +/NADP+. Trong nhiều trường hợp khác , chất làmngừng phản ứng có thể can thiệp quá mạnh vào phép định lượng sản phẩm phản ứngenzyme, ví dụ như chất làm ngừng phản ứng có cùng bước sóng hấp phụ ánh sáng cầnđo với chất phản ứng, hay ức chế phản ứng tạo màu tiếp theo của phân tích.5.2. Các phương pháp xác định hoạt độ enzymeViệc xác định hoạt độ của enzyme thường được các nhà khoa học đưa ra nhữngphương pháp rất cụ thể , ứng với từng loại cơ chất . Các phương pháp các định hoạt độenzyme chủ yếu dựa vào hai cách phân tích phản ứng enzyme, đó là phân tích lien tụcvà phân tích gián đoạn.a. Phân tích liên tục là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi hay sản phẩm tạothành một cách liên tục theo thời gian , ví dụ như cách đo hoạt độ của NADH oxidase(NOX) qua phản ứng: NADH + H+ + O2 NAD+ + H2O2 (do enzyme NOX sinh H2O2xúc tác)2NADH + 2H+ + O2 2NAD+ + 2H2O (do enzyme NOX sinh H2O xúc tác)Dựa vào sự hấp thụ ánh sáng của NADH ở bước sóng 340nm, người ta có thểtiến hành phản ứng trong một cuvet và đo sự biến đổi của NADH bằng quang phổ kế71theo thời gian ngay từ khi bổ sung enzyme vào dung dịc h phản ứng có chứa sẵn cơchất, hay bổ sung cơ chất vào hỗn hợp phản ứng đã chứa sẵn enzyme. Phương phápliên tục thường được sử dụng khi không có cơ chất hay cách làm ngừng phản ứngthích hợp, hoặc được áp dụng với một số enzyme dễ bị mất hoạt tính xúc tác ở điềukiện phân tích . Ngoài ra, các phương pháp phân tích liên tục còn được dùng phổ biếnvới các nghiên cứu hoạt động enzyme. Tuy nhiên, yêu cầu đối với thiết bị đo là phải cóbộ phận ổn nhiệt để phản ứng được thực hiện ở các nhiệt độ mong muốn . Đây cũng làmột hạn chế của phương pháp . Ngoài ra, do phải theo dõi sự biến đổi của chất phảnứng một cách liên tục nên khó có thể thực hiện phân tích hoạt độ của nhiều mẫuenzyme trong cùng một lúc.b. Phân tích gián đoạn là phương pháp cho enzyme tác dụng với cơ chất saumột khoảng thời gian nhất định thì làm ngừ ng phản ứng enzyme bằng cách thích hợpvà sau đó đo lượng cơ chất còn lại hoặc sản phẩm tạo thành. Đây là cách được sử dụngphổ biến nhất trong các phân tích hoạt độ enzyme hiện nay.Để làm ngừng phản ứng enzyme có thể dùng các tác nhân làm bất hoạt enzymenhư nhiệt độ cao , thay đổi pH (bổ sung acid hoặc kiềm ), dùng chất tạo phức hay táchenzyme ra khỏi hỗn hợp phản ứng v .v… phương pháp này khắc phục được những hạnchế của phương pháp đo liên tục , phản ứng có thể tiến hành trong tủ ấm hay bể ổnnhiệt, có thể tiến hành một lúc nhiều mẫu … Tuy vậy , vấn đề là phải tìm ra cách làmngừng phản ứng thích hợp.Dựa theo nguyên tắc xác định hoạt độ enzyme, bằng cách đo lien tục hay giánđoạn, hoạt độ enzyme có thể được xác định theo một hay một số phương pháp chínhsau đây:- Phương pháp đo độ nhớt: Sử dụng nhớt kế để đo sự biến đổi độ nhớt của dungdịch phản ứng. Phương pháp được áp dụng với các enzyme mà cơ chất có độ nhớt caohơn hẳn so với sản phẩm , thường là các cơ chất có khối lượng phân tử lớn như cácacid nucleic, protein…- Phương pháp phân cực kế: Sử dụng khi cơ chất và sản phẩm c ó khả năng làmquay mặt phẳng phân cực ánh sáng và có góc quay riêng khác nhau , ví dụ cho phảnứng phân giải sucrose bởi enzyme invertase. Sucrose có độ quay mặt phẳng phân cựclà +650, còn đối với glucose là +52,50, trong khi của fructose là -92,40. Chính vì vậysản phẩm tạo thành sẽ làm giảm mức độ quay mặt phẳng ánh sáng phân cực , từ phảisang trái.- Phương pháp đo áp suất hay áp kế : Chỉ dùng với các phản ứng enzyme có sựtiêu hao hay sinh khí, ví dụ như các phản ứng oxi hóa , decarboxyl hóa, loại amin hóa.Phản ứng sinh hay tiêu hao khí có thể trực tiếp hay gián tiếp . Ví dụ lipid với sự xúc táccủa lipase tạo ra glycerol và các acid béo , các acid béo khi có m ặt của NaHCO 3 sẽ tạora CO2 hay có sự loại amin do có sự tác dụng của các amino acid với HNO 2 tạo N2 bayra- Phương pháp quang phổ kế : Được sử dụng rất phổ biến , dựa trên khả nănghấp thụ ánh sáng ở các bước sóng xác đị nh của cơ chất , hoặc sản phẩm phản ứng . Vídụ: với enolase có thể đo sản phẩm phosphoenolpyruvate (PEP) tạo thành bằng cáchđo độ hấp thụ của PEP ở bước sóng 240nm. Còn với enzyme lactate dehydrogenasexúc tác cho phản ứng k hử pyruvate thành lactate thì có thể đo sự biến đổi của NADHqua sự hấp thụ ở bước sóng 340nm.72-Phương pháp chuẩn độ : Dùng cho sự phản ứng enzyme có sự hình thành acidhoặc base . Phương pháp yêu cầu giữ pH môi trường cố đị nh, lượng kiềm hoặc acidchuẩn dùng để chuẩn độ theo thới gian phản ánh hoạt độ enzyme.- Phương pháp sắc ký: Sử dụng sắc ký để phân tích sản phẩm phản ứng , ví nhưtách amino acid sau khi cho hai enzyme aminotranpherase lên cơ chất protease tácdụng lên cơ chất và sau đó định lượng các amino acid thu được . Đây là phương pháptốn thời gian nên ít được sử dụng.- Phương pháp hóa học: Dùng các phản ứng hóa học để định lượng cơ chất mấtđi hay lượng sản phẩm tạo thành . Thông thường phải tạo phản ứng tạo nên các phứcchất màu có độ hấp thu ánh sáng cực đại ở vùng nào đó để từ đó định lượng hợp chấtnày. Ví dụ trong phản ứng thủy phân tinh bột bởi α-amylase:Tinh bộtDextrinĐể đo hoạt độ của amylase , có thể dùng I 2 tác dụng với dung dịch tinh bột , sauđó đo cường độ màu xanh tím tạo thành để đánh giá lượng cơ chất còn lại , hay dùngphản ứng (màu) đặc trưng để xác định các dextrin có tính khử tạo thành.Phương pháp định lượng cơ chất còn lại , hay sản phẩm phản ứng tạo thành cóthể đơn giản là sự đo cơ chất còn lại , hay sản phẩm phản ứng tạo thành một cách trựctiếp như cách đo hoạt độ của lactate dehydrogenase (LDH). Tuy vậy trong nhiềutrường hợp, có thể phải đo cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành một cách gián tiếpvà do đó phép đo phức tạp hơn . Ví dụ để đo hoạt độ của pyruvate kinase , ngoài cáchđo phosphoenol pyruvate (PEP) hay ADP còn lại (mà không phải lúc nào cũng dễ thựchiện), người ta có thể đo pyruvate tạo thành tông qua sự ghép nối phản ứng với sự xúctác của LDH cùng với việc bổ sung NADH.- Phương pháp phóng xạ: dựa trên sự hình thành các bức xạ của các chất đồngvị phóng xạ gắn vào cơ chất tại nhóm chức thích hợp để có thể đo độ phóng xạ(sựphân rã) của cơ chất còn lại , hay sản phẩm tạo thành . Phương pháp phóng xạ thườngđược áp dụng để xác định hoạt độ của cácenzyme mà khi các phương pháp thôngthường (có độ nhạy thấp ) không thể đo được . Ví dụ , để đo hoạt độ của enzymeATPase (xúc tác phản ứng thủy phân ATP thành ADP và phosphate vô cơ), người tacó thể xác định lượng ATP còn lại , hay ADP , hoặc phosphate tạo thành bằng nhiềuphương pháp thông thường khác nhau . Tuy nhiên , khi hoạt độ của ATPase cực kỳthấp, người ta có thể dùng cơ chất là γ-[32P]-ATP, khi đó một trong hai thành phầnphản ứng (32P) có hoạt tính phóng xạ. Bằng cách phối hợp cả hai phương pháp : sắc kýbản mỏng để tách riêng γ-[32P]-ATP và gốc phosphate được giải phóng ra từ cơ chất ;đo độ phóng xạ bằng máy nhấp nháy lỏng để tính ra hoạt độ enzyme.- Phương pháp huỳnh quang: Phương pháp này dựa trên sự phát quang của mộtsố hợp chất dưới tác dụng của một nguồn sáng kích thích đặc trưng. Mức độ pháthuỳnh quang sẽ đo được nhờ máy huỳnh quang kế . Đây cũng là phương pháp có độnhạy cao, có thể phát hiện những enxyme có hoạt độ thấp.Bên cạnh những phương pháp phân tích hoạt độ có tính chất định lượng vừanêu trên, trong nghiên cứu enzyme, rất nhiều trường hợp phân tích định tính hay bánđịnh lượng cũng được sử dụng để nhanh chóng phát hiện hay bước đầu khẳng định cósự hiện diện của enzyme. Ví dụ, để phát hiện catalase , người ta chỉ cần bổ sung mộtlượng cơ ch ất là H 2O2 và xem bọt khí hình thành (do O2 được giải phóng ). Thườngđược dùng hơn trong nhận biết và bán định lượng hoạt độenzyme là phương phápkhuếch tán trên đĩa thạch (iod nhuộm với tinh bột , xanh coomasie hay amido đen vớicasein…) để xác định hay đánh giá hoạt độ enzyme qua vòng phân giải cơ chất . Ở73mức cần khẳng định hơn bản chất của các phản ứng có phải doenzyme xúc tác haykhông, người ta có thể xử lý nhiệt (đun cách thủy ít phút). Phần lớn các enzyme có bảnchất protein đều bị mất hay giảm phần lớn hoạt tính xúc tác sau khi xử lý ở nhiệt độcao. Trong một số trường hợp có thể dùng các chất ức chế đặc hiệu để giúp khẳng địnhsự có mặt của enzyme trong mẫu cần phân tích (như azide natri ức chế đặc hiệucatalase, phenyl metyl sulphonyl flourid-PMSF ức chế đặc hiệu các protease serine…)5.3. Phương pháp xác định hoạt độ một số enzyme thông dụng5.3.1. Xác định hoạt độ enzyme protease (phương pháp Anson)a. Nguyên tắc:Cho protease tác dụng với cơ chất là casein (hoặc hemoglobin), sản phẩm tạothành là các peptid ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin, tyrosine chiếm đa số.Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử folin , từ đó xác định hoạt độenzyme protease theo định nghĩa:Hình 3.6. Mô hình hoạt động của enzyme proteaseHoạt độ của protease được biều thị là số micromole tyrosine sinh ra do thuỷphân Casein bởi 1ml dung dịch hay 1 mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điềukiện chuẩn (35,50C, pH 7.6)b. Hoá chất:- Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hoà tan 5,96g Na2HPO4.12H2O trong nước thành250 ml- Dung dịch KH2PO4 1/15M: hoà tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml- Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7.6: trộn 177ml dung dịch Na2HPO41/15Mvà 23 ml dung dịch KH2PO4. đo và chỉnh lại pH cho đúng.- Dung dịch Casein 1%: đun sôi cách thuỷ 1g casein trong đệm Sorensen đến tanhoàn toàn rồi sau đó định mức bằng Sorensen cho đủ 100ml.- Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hoà tan 10g TCA trong nước cho đủ 100ml- Dung dịch NaOH 0,5N: hoà tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500 ml- Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250 ml.74- Dung dịch tyrosin 20mM/l: khuấy nghiền 0,118 g tyrosin trong dung dịch HCl0,2N vừa đủ 50ml- Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM/l: pha loãng 5 ml tyrosine 20mM/l trong HCl0,2N thành 100 mlc. Tiến hành thí nghiệm:Trước hết cần xây dựng đường chuẩn Tyrosine theo các nồng độ được trình bàytrong bảng 3.4Bảng 3.4. Dựng đường chuẩn tyrosinỐng nghiệm012345Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM/l00,20,40,60,81Dung dịch HCl 0,2N (ml)10,80,60,40,20Dung dịch NaOH 0,5N (ml)2222220,60,60,60,60,60,600,20,40,60,81Thuốc thử Folin (ml)Lượng tyrosin (micromol)ống.Lắc và để yên 10 phút đem đo mật độ quang ở bước sóng 660 nmVẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (OD) theo lượng tyrosin ở cácBảng 3.5. Xác định lượng tyrosin trong dung dịch nghiên cứuỐng nghiệmDung dịch hoá chấtThử thật (3 ống)Thử không (3 ống)Casein 1% (ml)55TCA 10% (ml)05Dịch enzyme mẫu (ml)10Lắc đều và giữ ở 35,5oC, trong 30 phútTCA 10% (ml)50Dịch enzyme mẫu (ml)01Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màuDịch lọc (ml)11Dung dịch NaOH 0.5N (ml)220,60,6Thuốc thử Folin (ml)Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bước sóng 660 nmd. Cách tính:Hoạt độ protease:HT (UI) =x.V .Kt.vx: số µ mol tyrosin suy ra từ đường chuẩnV: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (11 ml)75v: thể tích dịch lọc đem phân tích (1ml)K: đô pha loãng mẫut: thời gian phản ứng (30 phút)1 UI (Anson) = 1 micromol Tyrosine/ml/phút ;hoặc = 1 micromol/mg/phút5.3.2. Xác định hoạt độ enzyme α-amylase theo phương pháp Heinkel.a. Nguyên tắcAmylase xúc tác phản ứng thủy giải tinh bột thành đường ( đường đơn, đườngđôi hay dextrin phân tử lớn ). Lượng tinh bột còn lại phản ứng màu với iod.Xác định lượng tinh bột bị thủy giải, từ đó tính ra hoạt tính amylase theo địnhnghĩa:Hoạt tính amylase được biểu thị là số mg tinh bột bị thủy giải bởi 1ml dịchenzyme (hay 1mg nguyên liệu chứa enzyme) trong 1phút ở điều kiện chuẩn 500C, pH 6.b. Hóa chấtDung dịch NaH2PO4 0,05M: hòa tan 1,9502g NaH2PO4.2H2O trong nước thành250 ml.Dung dịch Na2HPO4 0,05M: hòa tan 0,8962g Na2HPO4.12H2O trong nước thành50 ml.Dung dịch đệm phosphate 0,05 M pH 6: trộn 87,7ml dung dịch NaH2PO4 0,05Mvà 12,3ml dung dịch Na2HPO4 0,05M thêm 100ml nước cất, đo lại pH bằng máy pHDung dịch tinh bột 1% pha trong pH 6: lấy 50ml dung dịch đệm phosphat 0,05MpH 6 đem đun sôi. Cân 1 g tinh bột tan, hòa vào một ít đệm, khuấy đều, đổ vào dungdịch đệm đang sôi, vừa khuấy vừa đun sôi trong 3 phút cho đến khi dung dịch trongsuốt. Định mức tới 100ml bằng dung dịch đệm.Dung dịch Iod: 1g I2 và 2g KI, thêm nước thành 100ml, bảo quản lạnh. Khi dùngpha loãng 500 lần.Dung dịch HCl 1N: 8,4ml HCl đậm đặc pha thành 100mlDung dịch HCl 0,1N: pha loãng từ dung dịch HCl 1NNaCl 0,1%c. Tiến hành thí nghiệmBảng 3.6. Dựng đường chuẩn tinh bộtỐng nghiệm123456Tinh bột 10mg/ml (ml)012345Dung dịch đệm (ml)543210Nồng độ tinh bột (mg/ml)0246810Hút 0,1ml dung dịch từ các ống nghiệm thêm 0,9 ml đệm, thêm vào 9 ml dungdịch I2KI đã pha loãng 500 lần.Đem so màu ở bước sóng 560nm.Vẽ đồ thị biểu thị mối tương quan giữa nồng độ tinh bột và giá trị ∆OD.76Bảng 3.7. Phản ứng enzymeThử thật ( 3 ống )Thử không ( 3 ống )Tinh bột 1% (ml)11NaCl 0,1% (ml)11Đệm Phosphate pH 6 (ml)22Lắc đều, để ổn nhiệt ở 50oC trong 5 phútDung dịch enzyme (ml)10Để ổn nhiệt ở 50oC, 10 phútDung dịch HCl 0.1N (ml)55Dung dịch enzyme (ml)01- Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm trên. Thêm vào mỗi ống nghiệm 9mldung dịch I2KI đã pha loãng 500 lần.- Lắc đều, đem đo OD tại bước sóng 560nm.d) Công thức tính toán: Hoạt độ α-Amylase trong 1ml dịch enzymeX*Kt*vTrong đó :X:Số mg tinh bột suy ra từ đường chuẩn.K:Hệ số pha loãng.v :Thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng enzymet :Thời gian enzyme phản ứng5.3.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme glucoamylasea. Nguyên tắcHoạt độ glucoamylase được tính dựa trên lượng gluco tạo ra khi thủy phân tinhbột bằng enzyme. Hàm lượng gluco được xác định bằng cách đo mật độ qua ng củadung dịch khi có mặt thuốc thử DNS (3,5 dinitro Salicilic acid ) tại bước sóng 520 nm.Một đơn vị hoạt độ glucoseamylase xúc tác thủy phân tinh bột giải phóng mộtµmolgluco trong một phút, ở điều kiện xác định.Hình 3.7. Cấu trúc không gian của phân tử glucoamylase77b. Hóa chấtHồ tinh bột 2%, dung dịch đệm acetate 0,15 M, pH 5, thuốc thử DNS (hòa tan0,5 g DNS trong 100 ml NaOH 2N và 150g muối kép Na-K Tartrate ở nhiệt độ phòng,sau đó thêm nước cất cho đến 500 ml)c. Tiến hànhChuẩn bị các ống chứa 3ml DNS. Cho 1ml enzyme đã pha loãng ở mức độ thíchhợp vào ống chứa 2ml hồ tinh bột và 2ml đệm acetate. Cho 1ml hỗn hợp phản ứng vàoống chứa 3ml DNS để xác định lượng đường khử tại thời điểm 0 trước khi ủ ở nhiệt độthí nghiệm trong 10 phút. Cho 1ml dịch mẫu sau khi đã ủ 10 phút vào các ống chứa3ml DNS. Các ống được đun cách thủy 10 phút, sau đó làm nguội . Xác định mật độquang tại bước sóng 520 nm, sử dụng ống đối chứng là dung dịch 3ml DNS và một mlnước cất.Tính lượng đường khử tạo ra dựa trên đường chuẩn Gluco với hàm lượng từ100­500 ug/mld. Cách tính hoạt độ enzyme glucoamylaseHoạt độ enzyme glucoamylase được biểu hiện bằng lượng gluco giải phóng bởienzyme tác dụng trong thời gian 1 phút, ở điều kiện xác định.Hoạt độ GA =µmol gluco x L (hệ số pha loãng)Thời gian (phút) x m= UI/gCPE- m: khối lượng CPE (g)5.3.4. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulasea. Nguyên tắcCellulase thuộ c nhóm enzyme thủy phân (Hydrolase), là enzyme thủy phâncellulase thành cellubiose qua việc xúc tác thủy giải liên kết 1,4-b-glucosid.Hình 3.8. Mô hình hoạt động của enzyme cellulase trên bề mặt celluloseĐể xác định hoạt độ en zyme cellulase , ta cẩn sử dụng CMC (carboxyl methylcellulose) như cơ chất , ủ dịch chiết enzyme với CMC trong24 giờ ở pH 5,5. Hệ78enzyme cellulase sẽ tác dụng lên CMC , phóng thích các phân tử glucose , dựa vào hàmlượng glucose xác định hoạt độ enyzm cellulaseb. Tiến hànhHỗn hợp phản ứng gồm : 1ml dịch chiết, 3ml dung dịch cơ chất , 3ml dung dịchđệm. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau thời gian ủ, hỗn hợp được lọc qua giấy lọcđể thu phần dịch trong.Lấy 0,5 ml dịch lọc , pha loãng thành 20ml bằng nước cất trong ống nghiệm .Lấy 1ml dịch lọc đã pha loãng ở trên đem xác định hàm lượng glucose tạo thành bằngcác phương pháp xác định hàm lượng đường khử . Từ hàm lượng gl ucose, xác địnhđược hoạt độ cellulase.5.3.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme lipaseHình 3.9. Cấu trúc không gian của enzyme lipasea. Nguyên tắc:Xác định hoạt độ lipase theo hàm lượng acid béo được giải phóng ra từ lipiddưới tác dụng của lipase bằng dung dịch KOH.Hoạt độ lipase được biểu thị bằng số ml KOH đã dùng để chuẩn độ acid béo tạothành từ sự thủy phân lipid có trong 1 lít sữa.b. Tiến hànhLấy hai erlen 100ml, cho vào mỗi bình 10ml sữa tươi.Bình 1 (bình thí nghiệm ): cho vào 2ml lipase, lắc đều, đặt vào bình ổn nhiệt ở037÷40 C trong 1 giờ.Bình 2 (bình kiểm tra): đun sôi sữa trong bình , sau đó cho ngay 2ml lipase vàovà đun sôi tiếp 5 phút. Để ngu ội đến nhiệt độ phòng , sau đó đặt vào bồn ổn nhiệt ở37÷400C trong 1 giờ.Sau1 giờ lấy bình ra , thêm vào mỗi bình8ml cồn tuyệt đối , vài giọtphenolphtalein, chuẩn độ cả hai bình bằng KOH 0,1N. Từ lượng KOH cần chuẩn độ ,79xác định được lượng acid béo tạo thành sau khi thủy phân lipid bằng lipase và từ đóxác định được hoạt độ enzyme lipase.5.3.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme ureaseHoạt độ urease được xác định theo phương pháp so màu với thuốc thử Nesler.a. Nguyên tắc :Dùng phản ứng màu với thuốc thử Nesler để định lượng amoniac được tạothành trong phản ứng dưới tác dụng urease.1 đơn vị hoạt tính urease là lượng enzyme có thể tạo thành 1 µmol amonia mỗiphút ở 30oC trong đệm phosphat pH = 6.5.b. Tiến hành:Cho vào ống nghiệm 0,4 ml nước cất và 0,5 ml dung dịch urea 3% trong đệmphosphat 0,5M, pH=7.Giữ ống nghiệm trong tủ ấm đến khi đạt 30oC. Sau đó thêm 0,1 ml dung dịchurease có độ pha loãng thích hợp, lắc đều, giữ 30 oC trong 5 phút.Làm ngừng phản ứng bằng cách thêm 0,5 ml dung dịch HCl 1M lắc đều.Xác định amoniac như sau: lấy 0,15 ml hỗn hợp phản ứng cho vào ống nghiệm ,thêm 7 ml nước, 0,5 ml thuốc thử Nesler và thêm nước vào đến 10 ml.Lắc đều, so màu trên máy quang điện với kính lọc màu xanh lục.Mẫu đối chứng: thay 0,15 ml hỗn hợp phản ứng bằng nước cất.c.Hóa chất:- Dung dịch enzyme cần điều chỉnh pH đến 6,5. Cần pha loãng dung dịchenzyme thế nào để 0,1 ml enzyme trong điều kiện thí nghiệm tạo thành 0,1 – 0,25 mgnitơ amoniac.- Thuốc thử Nesler: hòa tan 10 g KI trong 15 ml nước cất, thêm 15g HgI2, khuấycẩn thận và thêm 80 ml dung dịch NaOH 50%. Khuấy đều, thêm nước cất cho đến 500ml. Để một ngày đêm ở trong phòng , lọc qua bông thủy tinh , nhận được dung dịchtrong suốt.d.Lập đồ thị chuẩn:Chuẩn bị dung dịch gốc NH4Cl hoặc (NH4)2SO4 có chứa 50µg amoniac/1ml.Lấy 7 bình định mức 10 ml, cho vào mỗi bình 8 ml nước cất. Hai bình dùng làmmẫu đối chứng để so màu , 5 bình còn lại, cho thêm vào các bình theo thứ tự 0,2; 0,4;0,6; 0,8 và 1 ml dung dịch gốc.Thêm vào tất cả 7 bình mỗi bình 0,5 ml thuốc thử Nesler, thêm nước cất vào chođến vạch 10 ml. Lắc đều, đo OD trên máy quang điện kế với kính lọc màu xanh lục.Thực hiện phản ứng tương tự như đã ghi ở phần trên.Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến t hiên của mật độ quang (∆OD) theo nồng độ NH 3chuẩn (µmol/ml).80TÓM TẮT CHƯƠNG 3Điện di là phương pháp nhằm đánh giá mức độ tinh sạch của protein , cơ sở củaphương pháp điện di đó là các phân tử protein khác nhau sẽ di chuyển với vận tốc khácnhau trong điện trường . Sự di chuyển khác nhau này có thể là do kích thước củaprotein hoặc là do điểm đẳng điện của protein là khác nhau giữa các loại khác nhau.Sau khi đã được tinh sạch và điện di , protein thu được cần phải được kiểm tra đểkhẳng định chắc chắn đây là protein mục tiêu cần thu nhận . Để thực hiện điều này ,người có thể thực hiện nhiều phương pháp nhưng thong dụng hơn cả đó là phươngpháp lai thẩm tích (Western Blot), cơ sở của phương pháp này đó là dựa vào khả nănglien kết đặc hiệu giữa protein và kháng thể tương ứng.Trong các phương pháp phân tích protein , xác định hàm lượng protein là nhằmđể đánh giá lượng protein hiện di ện trong đối tượng cần nghiên cứu là nhiều hay ít .Ngoài ra xác định hàm lượng protein còn là cơ sở để đánh giá chất lượng enzyme thuđược thong qua giá trị hoạt độ riêng . Các phương pháp xác định hàm lượng proteinthường s ử dụng là phương pháp quang phổ, phương pháp Lowry , phương phápBradford, phương pháp acid bicinchronic.Trong những nghiên cứu về enzyme, giá trị quan trọng để đánh giá chúng đó làkhả năng xúc tác phản ứng hay còn gọi là hoạt độ enzyme. Hoạt độ enzyme biểu thịqua lượng cơ chất bị phân giải hoặc lượng sản phẩm tạo thành sau phản ứng enzyme.81