 Loading Preview Sorry, preview is currently unavailable. You can download the paper by clicking the button above.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINHVIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN : SINH HỌC ĐẠI CƯƠNGĐỀ TÀI :Lớp : ĐHTP4GVHD : ThS Trần Đức ViệtSinh viên thực hiện :1. 08243421 Bùi Thị Bích Hằng2. 08104521 Nguyễn Thị Thu Hằng3. 08212521 Nguyễn Bảo Khuyên4. 08108721 Đỗ Trọng Lam5. 08234201 Nguyễn Mỹ Linh6. 08105241 Nguyễn Thị Thuỳ LinhNiên khoá : 2008-2012T.P Hồ Chí Minh, 11/2009PHẦN MỞ ĐẦU~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~Công nghệ tái tổ hợp DNA còn gọi là công nghệ di truyền - là sự kết hợp của sinh học phân tử và di truyền học - ra đời vào những năm đầu của thập niên 70 trong thế kỷ 20. Phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên được nhóm các nhà nghiên cứu Mỹ là Berg, Boyer và Cohen tạo ra năm 1972Sau đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và tiến hành các thí nghiệm lắp ghép gen và đã thu được nhiều kết quả ứng dụng được trong thực tiễn.Kỹ thuật tái tổ hợp DNA ngày càng có nhiều ảnh hưởng đến nông nghiệp, công nghệ thực phẩm, y dược, bảo vệ môi trường, như: sản xuất thuốc kháng sinh, vác xin, kháng thể đơn dòng và các protein có hoạt tính sinh học dùng để chữa bệnh như insulin chữa bệnh tiểu đường, interferon chữa bệnh ung thư, các hormon tăng trưởng cho con người. Xác định vị trí của các gen mã hóa cho các tính trạng mong muốn, giúp cho việc lai tạo, chọn giống cũng như tạo ra các sinh vật chuyển gen nhanh và hiệu quả cao, Trong công nghệ thực phẩm, công nghệ tái tổ hợp DNA đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo ra các vi sinh vật chuyển gen mang các tính trạng mong muốn nhằm tạo ra năng suất và chất lượng cao cho sản phẩm. Ví dụ: o Trong sản xuất rượu, ngày nay người ta đã dùng các chủng vi sinh vật có khả năng tạo rượu cao và cho hương vị tốt. Phần lớn các chủng đó được nghiên cứu, tuyển chọn, lai tạo bằng kĩ thuật tái tổ hợp DNAo Đối với các sản phẩm lên men sữa như phomat và sữa chua, trước kia, người ta thường sử dụng những vi sinh vật tự nhiên để lên men nên khó kiểm soát quá trình lên men và hiệu quả không cao. Ngày nay, với kĩ thuật tái tổ hợp DNA, người ta đã tạo được các chủng mới với các tính chất xác định và đã điều khiển được quá trình lên men theo định hướng mong muốn.2o Trong những năm gần đây, bằng cách sử dụng kĩ thuật tái tổ hợp, người ta đã tuyển chọn và tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme chịu nhiệt, chịu axit, chịu kiềm tốt để sản xuất enzyme. Enzyme λ - amylase chịu nhiệt đã và đang được sử dụng nhiều để sản xuất nha, đường glucose từ tinh bộtChính vì vậy nhóm chúng tôi đã quyết định chọn đề tài tiểu luận môn Sinh học đại cương là “Kĩ thuật tái tổ hợp DNA” để tìm hiểu rõ hơn và nắm vững phương pháp tiến hành của kĩ thuật này.Tiểu luận được thực hiện dựa trên việc tìm kiếm và tổng hợp các tài liệu. Đối tượng nghiên cứu chủ yếu là vi khuẩn3PHẦN NỘI DUNG~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~1. Nguyên lí cơ bản của kĩ thuật tái tổ hợp DNACông nghệ di truyền sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để tách DNA từ một cơ thể sống và sau đó cắt, nối các gen trên DNA. Bằng cách như vậy, người ta có thể loại bỏ các gen không mong muốn và đưa vào các gen mới đặc hiệu theo chủ ý lựa chọn. Các thao tác cắt, nối trên DNA được thực hiện bên ngoài cơ thể sống trong các ống nghiệm (in vitro). Phân tử DNA mới được tạo dựng sau các thao tác cắt, nối có một số đặc điểm khác với phân tử DNA ban đầu được tách ra từ tế bào sống, được gọi là DNA tái tổ hợp và kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Sự tái tổ hợp DNA được xem là thành công chỉ sau khi đưa được phân tử DNA tái tổ hợp vào trong tế bào sống và chúng biểu hiện các hoạt tính di truyền và ở thế hệ con cháu sẽ mang phân tử DNA tái tổ hợpKỹ thuật tái tổ hợp DNA được thực hiện qua nhiều bước:- Bước 1 : Nuôi tế bào cho plasmid để có vector chuyển gen và nuôi tế bào cung cấp gen cần chuyển- Bước 2 : Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho- Bước 3 : Phân lập hai loại DNA bằng cùng một loại enzym giới hạn- Bước 4 : Trộn chung hai loại DNA đã bị cắt- Bước 5 : Bổ sung enzym nối ligase để tạo ra ADN tái tổ hợp hoàn chỉnh.- Bước 6 : Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng.- Bước 7 : Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ mang ADN tái tổ hợp và theo dõi hoạt động, biểu hiện của gen thông qua sản phẩm của gen lấy từ tế bào cho.4Hình: Các bước tạo DNA tái tổ hợp1,2: Cắt DNA của tế bào cho và plasmid bằng cùng một loại enzyme giới hạn3 : Đưa DNA tái tổ hợp vào trong tế bào nhận4 : Nhân dòng2. Các enzyme sử dụng trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA2.1 Enzyme giới hạn RE (Restriction Enzyme)Trong công nghệ di truyền muốn tạo ra ADN tái tổ hợp để đưa vào tế bào chủ cần phải có công cụ cắt plasmid hình vòng và đoạn ADN của tế bào rồi cho chúng nối lại với nhau. Công cụ cắt ADN là các enzym giới hạn52.1.1 Khái niệm về enzym giới hạnThông thường tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage (thể thực khuẩn) thì vi khuẩn đó bị phage phá huỷ. Một số chủng vi khuẩn sau khi bị nhiễm phage lại không bị phá huỷ, do trong tế bào vi khuẩn này có loại enzym có khả năng cắt DNA phage thành những đoạn nhỏ. Năm 1970, Hamilton Smith là người đầu tiên tách được loại enzym này từ loại vi khuẩn Haemiphilus influenzae được gọi tên là HinII. Ngay sau đó, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng, phần lớn các loài vi khuẩn mang loại enzym có chức năng cắt DNA lạ xâm nhập để bảo vệ tế bào khỏi bị xâm nhập của các DNA lạ. Những enzym đó được gọi là enzym giới hạn.Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất định và cắt DNA ở ngay điểm này hay ở điểm kế cận. Tuỳ theo phương thức cắt và nguồi gốc của enzym giới hạn mà người ta phân loại và đặt tên cho các enzym giới hạn đó2.1.2 Phân loại enzym giới hạnCác enzym giới hạn được phân thành 3 loại: I, II và III.Các enzym giới hạn được dùng phổ biến trong công nghệ DNA tái tổ hợp thuộc kiểu II. Bao gồm những enzyme có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu. Khi nhận biết được trình tự đó, chúng cắt ngay tại vị trí nhận biết. Các enzym này cắt bên trong mạch DNA (không phân huỷ từ 2 đầu của DNA) nên còn được gọi là enzym endonuclease. Enzym giới hạn kiểu II thực chất là endonuclease giới hạn kiểu II.Các enzym giới hạn kiểu II: Cách gọi tên các enzym giới hạn kiểu II cũng như các enzym giới hạn khác dựa trên quy ước chung. Tên enzym giới hạn được ghép bởi chữ cái đẩu tiên là tên chi và hai chữ tiếp theo là hai chữ cái tên loài của vi sinh vật mà enzym được tách chiết. Nhưng chữ và số La mã tiếp theo là tên của chủng và dòng của loài sinh vật cụ thể đã tách chiết enzym:Ví dụ: E.coRI (thuộc chi Escherichia, loài coli, chủng Ry 13) Một số loại khác như E.coRV, BamHI, HaeIII, Smal, …62.1.3 Tính đặc hiệu vị trí- Trình tự nhận biết của RE: Đặc trưng quan trọng nhất của các trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc đối xứng nghịch đảo (palindromic), nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng được đọc theo chiều 5’ đến 3’ ở mỗi sợi đơn. Các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn được cấu tạo từ 4 đến 6 đôi base. Ví dụ như đoạn DNA được đóng khung sau:- Các kiểu cắt của RE: Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA ngay chính giữa palindrom, tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng. Sau khi cắt, hai đầu không có khả năng tự kết hợp trở lại. Ví dụ:Cắt đầu dính (đầu lệch): Cắt bên này và bên kia của tâm đối xứng để tạo ra hai đầu lệch nhau một vài base. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bị bắt cặp trở lại.Ví dụ:72.2 NucleaseCác enzym nuclease phân hủy các axit nucleic bằng cách làm đứt các liên kết phosphodieste là liên kết nối các nucleotit cùng một mạch với nhau. Các nuclease có khả năng phân cắt phân tử DNA hoặc RNA. Có ba kiểu phân loại các nuclease:1 - Dựa vào bản chất của cơ chất mà nó tác dụng, người ta chia nuclease làm 2 loại:- Deoxyribonuclease (DNase), cơ chất của nó là DNA- Ribonuclease (RNase), cơ chất của nó là RNA2 - Dựa theo kiểu liên kết mà enzyme thủy phân, người ta cũng chia ra làm hai loại:- Nuclease "a": Thuỷ phân đặc hiệu liên kết phosphodiester giữa cacbon(C3’) và nhóm phosphate.- Nuclease "b": Thuỷ phân đặc hiệu liên kết phosphoester giữa cacbon(C5’) và nhóm phosphateHình: Phân loại nuclease theo liên kết bị cắt83 - Dựa theo hoạt tính enzyme, người ta cũng chia ra làm hai loại exonuclease và endonuclease:- Exonuclease: Cắt các liên kết phosphoester từ hai đầu của chuỗi polynucleotide và từ đó cắt dần từng nucleotide, chúng đòi hỏi là phải có nhóm OH (3’) hoặc OH (5’) tự do ở hai đầu chuỗi.- Endonuclease: Thường thuỷ phân liên kết phosphoester ở vị trí bất kỳ bên trong chuỗi và tạo ra các oligonucleotide.Các loại nuclease chủ yếu:- Enzym ADNase I (endonuclease) tách chiết từ tụy của bò, xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết ngay sau một bazo nito ở cả mạch đơn và mạch kép hoàn toàn ngẫu nhiên.- Enzym S1 nuclease (endonuclease) là enzym tách chiết từ nấm mốc Aspegillus oryzae. S1 nuclease BAL 3 (endonuclease) phân cắt cả 2 đầu 5’ và 3’ của ADN và không có khả năng cắt nội liên kết.- Enzym exonuclease III là một 3’ exonuclease cắt đầu 3’ của mạch đơn và tạo thành các đoạn ADN có đầu 5’ nhô ra.- Enzym ARNase tách chiết từ tụy bò. Enzym này thường được sử dụng để loại bỏ ARN trong hỗn hợp ADN và ARN.- Enzym ARNase H dùng để loại bỏ ARN trong các phân tử lai ADN-ARN, nhất là sau phản ứng phiên mã ngược để hình thành mạch thứ hai của cADN, từ đó tạo nên phân tử cADN kép.92.3 Enzyme nối2.3.1. LigaseĐể kết nối hoặc hàn hai mảnh DNA hoặc RNA người ta phải sử dụng enzyme ligase trong sự có mặt của ATP. Khi đó tạo ra một liên kết ester giữa một mảnh chứa 5’ −phosphat và một mảnh chứa 3’−OH => liên kết phosphodiester. Chúng thường được sử dụng kết hợp với enzyme khác như kinase và alkaline phosphatase. Thông thường, chắp hai mảnh đầu dính dễ hơn hai mảnh có đầu phẳng.Có 3 loại enzym nối thường dùng trong công nghệ di truyền:- Enzym E.coli ADN ligase được tách chiết từ vi khuẩn E.coli, xúc tác phản ứng nối hai đoạn trình tự ADN có đầu sole.- Enzym T4 ADN ligase được tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm vào E.coli, có chức năng giống như E.coli ADN ligase nhưng lại có khả năng nối hai đoạn trình tự ADN có đầu bằng và là enzym nối được ưa chuộng nhất hiện nay.- Enzym T4 ARN ligase tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm E.coli, có khả năng nối hai trình tự ARN bằng các liên kết phosphodiester.Ngoài các loại enzym nối kể trên, hiện nay người ta còn sử dụng các đoạn nối (đầu dính–adaptor) cho các enzym cắt đầu bằng. Adaptor xúc tác nối các đoạn ADN do có các enzym giới hạn cắt đầu bằng từ đó tạo nên đầu so le. Mỗi đoạn enzym cắt đầu bằng đều có các loại adaptor đặc trưng riêng.2.3.2. Các enzyme dephosphoryl hoá ( khử nhóm PO4-3 )Alkaline phosphatase:Được trích ly từ E. Coli hay từ ruột bê. Đặc tính của enzyme này là hoạt động ở pH kiềm và có khả năng xúc tác khử nhóm phosphate 5’ của một chuỗi DNA hoặc RNA và các nucleotide tự do.Alkaline phosphatase được ứng dụng để:- Loại bỏ nhóm phosphate 5’ trên trình tự DNA hoặc RNA trước khi đánh dấu phóng xạ 5’ của chúng bằng P32 làm mẫu dò phân tử lai.- Loại bỏ nhóm phosphate 5’ trên một vector vừa mới bị cắt bởi enzyme RE. Nhằm tránh vector này đóng kín trở lại, khiến cho việc cài mảnh DNA ngoại lai vào bị cản trở. Trong trường hợp này, sợi kép được cài vào có mang hai nhóm phosphat ở 5’ sẽ tạo ra hai trong bốn liên kết este để hình thành một DNA tái tổ hợp kép vòng kín có chứa hai khe hở.10Hình: Phản ứng nối DNA ngoại lai với vector đã khử nhóm PO4.3Sự chắp nối vector đã bị khử PO4.3 ở 5’ với DNA ngoại lai tạo ra DNA tái tổ hợp sợi kép có hai chỗ trống (OH) do OH 3’ của đoạn ngoại lai không tạo liên kết ester với OH 5’ của vector đã khử nhóm PO4.32.4 Các enzym polymerase2.4.1 Khái niệmCác enzym polymerase xúc tác cho quá trình sao chép các axit nucleic (ADN, hoặc ARN) được sử dụng nhiều trong công nghệ tái tổ hợp DNA. Khi nói về một enzym polymerase nào đó, người ta thường dùng thuật ngữ “ phụ thuộc ADN ” hoặc “ phụ thuộc ARN ” để chỉ axit nucleic mà enzym này xúc tác cho việc sao chép. ADN polymerase phụ thuộc ADN thì sao chép ADN sang ADN; ADN polymerase phụ thuộc ARN thì sao chép ARN sang ADN, còn enzym ARN polymerase phụ thuộc ADN thì phiên mã ADN sang ARN. Các enzym này tổng hợp axit nucleic bằng cách nối các nucleotit với nhau theo nguyên tắc bổ sung dựa theo mạch khuôn. Quá trình tổng hợp mạch mới bổ sung diễn ra theo chiều 5’-3’ và sự khởi đầu cần có đầu 3’-OH tự do.112.4.2 Phân loạiCác enzyme DNA polymerase: Enzym ADN polymerase I, Enzym T4 ADN polymerase, Enzym Taq polymerase…Hiện nay còn có nhiều loại ADN polymerase khác lưu hành trên thị trường như T7 ADN polymerase, Vent ADN polymerase …Các enzyme RNA polymerase: Có ba loại enzym ARN polymerase thường được dùng trong thực tế, đó là SP6 ARN polymerase, T3 ARN polymerase và T7 ARN polymerase …Enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase): Có khả năng tổng hợp DNA một mạch gọi là DNA bổ trợ (cDNA) từ khuôn mARN, hoặc từ một đoạn polynucleotit được tổng hợp bằng con đường hóa học. Nhờ có con đường phiên mã ngược này mà có thể tổng hợp được hầu hết các gen riêng biệt nào đó nếu như có mặt mARN của gen đó. Các cDNA mạch đơn có thể biến thành mạch kép nhờ DNA polymerase và được gọi là cDNA mạch kép (c-DNA duplex). Đoạn cDNA mạch kép có thể gắn vào plasmid rồi biến nạp vào vi khuẩn, từ đó tạo dòng c-DNA. Nếu cDNA có nguồn gốc từ một gen thì ta tạo được dòng gen. Trong trường hợp mARN trưởng thành khi đã ở ngoài nhân thì ta sẽ thu được dòng gen chỉ chứa những đoạn mã hóa (exon). Không có đoạn không mã hóa (intron).3. Thu nhận genNgày nay, người ta có thể thu nhận gen để thực hiện kỹ thuật di truyền bằng ba phương pháp: tách chiết DNA trực tiếp từ tế bào, tổng hợp bằng phương pháp hoá học, tổng hợp từ mARN tương ứng3.1 Tách chiết DNA trực tiếp từ tế bàoĐây là phương pháp sử dụng rộng rãi ngay từ buổi đầu tiên của sự phát triển kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Toàn bộ phân tử DNA của một sinh vật được cắt nhỏ thành những đoạn có kích thước 1,5÷2kb bằng restriction enzyme (RE).Điện di hoặc sắc kí để tách đoạn DNA tinh khiết.Nhược điểm: tốn nhiều công sức và thời gian nhưng ngày nay người ta vẫn sử dụng để tạo ngân hàng DNA bộ gen (genonic DNA libraries).3.2 Tổng hợp bằng phương pháp hoá họcNăm 1969, gen nhân tạo đầu tiên được tổng hợp do nhóm nghiên cứu Khorama, đó là gen mã hoá tổng hợp tRNA vận chuyển amino axit (alamin) ở nấm 12men gồm 77 cặp nucleotide. Gen đầu tiên không được biểu hiện vì không có các trình tự điều hoà.Về sau, chính nhóm này đã tổng hợp được gen có hoạt tính: đó là gen mã hóa cho chất ức chế tRNA vận chuyển tyrosine ở E. Coli, có chiều dài khoảng 200 cặp nucleotide.Vào năm 1977, K. Itakura và Boyer đã tổng hợp được gen mã hóa sinh tổng hợp hormone somatostatin của động vật có vú được biểu hiện ở E. Coli. Và từ đó, nòi E. Coli mang gen tổng hợp hóa học được tạo ra. Sau này, người ta tổng hợp hóa học gen mã hóa hormone tăng trưởng của người dàì 584 cặp nucleotide.Phương pháp tổng hợp hóa học gen cũng được sử dụng để tạo ra nòi vi khuẩn tổng hợp insulin, một loại hormone chữa bệnh tiểu đường cho người. Gen insuline được tổng hợp từ hơn 40 đoạn oligonucleotide khác nhau, sau đó, được nối lại nhờ enzyme lygase để tạo ra hai chuỗi polynucleotide dài 271 và 286 cặp nucleotide mã hóa, tổng polypeptide A có 21 aminoaxit, polypeptide B có 30 aminoaxit.Qua các kết quả thu được, các nhà khoa học đã khẳng định rằng: muốn tổng hợp được gen bằng phương pháp hoá học cần phải biết trình tự của axit amin ở protein mà gen đó chịu trách nhiệm tổng hợp.3.3 Tổng hợp từ mRNA của gen tương ứngTổng hợp cDNA từ mRNA nhờ kỹ thuật của Gubler và Hoffman với sự có mặt của enzyme phiên mã ngược (Rever transcriptase). Sau đó, cDNA (complementary) gắn vào plasmid và biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng cDNA.Phương pháp:- Tổng hợp cDNA sợi kép đầu bằng từ mRNA dưới tác dụng của enzyme sao chép ngược.- Metyl hóa các vùng hạn chế (có trong đoạn cDNA sợi đôi) được nhận biết bởi enzyme EcoRI để bảo vệ vùng này không bị cắt khi thao tác với EcoRI.- Tạo đầu dính bằng cách sử dụng đoạn nối linker có chứa trình tự nhận biết bởi EcoRI, sau đó, cắt bằng enzyme EcoRI. Trong trường hợp này, chỉ có đoạn nối bị cắt còn cDNA vẫn còn nguyên vẹn (do được metyl hóa). Đưa cDNA vào vector tạo DNA tái tổ hợp.- Ghép cDNA đầu dính vào vector thích hợp đã được mở EcoRI và đã khử nhóm phosphat.13- Hàn kín mạch nhờ enzyme phosphoryl hóa và enzyme ligase để tạo vector tái tổ hợp.- Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nuôi cấy trong các điều kiện thích hợp để tạo dòng.Ưu điểm: Gen thu nhận bằng phương pháp này đã loại bỏ được những trình tự không mã hoá. Bằng con đường này, người ta đã tạo dòng gen mã hoá tổng hợp globine của người, động vật và chim, protein thủy tinh thể mắt bò, ovalbumine (protein lòng trắng trứng) và fibroin tơ tằm.Phương pháp tổng hợp gen từ mRNA ngày càng được phát triển, nó kết hợp với các phương pháp khác của sinh học phân tử và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.Hình: Sơ đồ tổng hợp gen từ mRNA4. Vector chuyển genTrong kĩ thuật tái tổ hợp DNA, chúng ta không thể đưa trực tiếp một gen từ tế bào này sang tế bào khác mà cần thông qua một phương tiện để chuyển gen được gọi là vector chuyển gen4.1 Yêu cầu của vector chuyển genPhải có trình tự nhận biết để enzyme restriction endonuclease có thể nhận biết và cắtVector phải có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào chủ, không phụ thuộc vào sự sao chép bộ gen của tế bào chủ14Có trình tự điều hoà thuận lợi cho sự phiên mã gen lạCó kích thước tương đối nhỏ để dễ xâm nhập vào tế bào.Có khả năng tạo nhiều bản sao để khi tách khỏi tế bào được số lượng lớn, đảm bảo sự khuếch đại của gen lạ mong muốn được gắn vào.Dễ theo dõi sự biểu hiện của gen tái tổ hợp, yêu cầu này là cần thiết cho việc phát hiện dòng cần tìm (chứa các gen đánh dấu, thường là các gen kháng chất kháng sinh, hoặc gen tổng hợp chất màu)4.2 Vector chuyển gen là plasmidCác plasmid là những mẫu DNA nhỏ, ngắn, dạng vòng (khép kín), sợi đôi nằm ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy đầu tiên trong tế bào một số vi khuẩn. Chúng sao chép được là nhờ một số enzyme có mặt trong tế bào vi khuẩn và không phụ thuộc vào sự sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn do mỗi plasmid đều có vị trí khởi đầu phiên mã (ori) riêng.Do kích thước nhỏ nên plasmid chỉ chứa rất ít gen chọn lọc, thường đặc tính chọn lọc là kháng kháng sinh. Từ khi được phát hiện đến nay, các plasmid không ngừng được cải tiến và ngày càng được có thêm nhiều đặc tính quí cho việc tạo dòng.Trong phòng thí nghiệm, người ta sử dụng các plasmid nhân tạo mà được tạo ra từ các plasmid tự nhiên và cài thêm một số chuỗi DNA.4.2.1 Các plasmid thế hệ thứ nhấtLà những plasmid đầu tiên được sử dụng để tách dòng - được tìm thấy trong tự nhiên như pSC101 (Stalay-Cohen), ColE1. Tuy vậy các plasmid này có rất ít những đặc tính cần thiết. Sau này, các nhà nghiên cứu đã tìm ra các plasmid nhân tạo thế hệ hai, ba bằng cách tập trung nhiều đặc tính quí của nhiều plasmid tự nhiên vào một cấu trúc duy nhất.4.2.2 Plasmid thế hệ thứ haiPlasmid thế hệ thứ 2 được tạo ra bằng cách kết hợp các đặc tính quý của nhiều plasmid tự nhiên, gắn thêm gen chỉ thị để tạo nên một plasmid mới. Điển hình cho plasmid thế hệ thứ hai và cũng là một trong những plasmid được sử dụng rộng rãi nhất trong Công nghệ di truyền, đó là plasmid pBR322pBR322 - là plasmid được sử dụng rất phổ biến vào những năm 1980 để nhân dòng trong tế bào E. Coli. Nó được tìm ra vào năm 1977 bởi Bolivar Rodrigues.15Hình: Cấu tạo plasmid pBR322Có nhiều điểm nhận biết bởi enzyme cắt hạn chế và trong số đó có nhiều điểm nhận biết nằm trong gen kháng kháng sinh. Ví dụ: gen kháng ampicilline (AmpR )có ba trình tự nhận biết bởi ba enzyme cắt hạn chế là PstI, PvuI, ScaI. Còn gen kháng tetracycline (TetR )có sáu điểm nhận biết là: EcoRV, BamHI, SphI, SlaI, XmaIII, NnuI.Ưu điểm của pBR322 là chúng có số bản sao lớn. Thực nghiệm cho thấy cứ 15 plasmid tái tổ hợp được biến nạp trong E. Coli, số lượng này có thể tăng lên từ 1.000 đến 3.000 bản sao trong điều kiện nuôi cấy tốt.4.2.3 Các plasmid thế hệ baĐây là các plasmid mạnh và đa năng, tiện sử dụng cho nhiều loại RE khác nhau với hàng chục trình tự nhận biết của chúng được nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là polylinker. Kích thước nhỏ, sao chép nhanh trong tế bào vi khuẩn, tạo số lượng bản sao lớnCác plasmid thế hệ 3 được chia làm 3 nhóm lớn:- Dãy pUC như: pUC18, pUC19- Dãy Gemini: Plasmid pGEM3, Plasmid pCR 2.1- Nhóm các plasmid Bluescript4.3.2.1 Dãy pUC:pUC là plasmid của University California, có kích thước 2,6kb và có một số đặc trưng sau:16(PstI, PvuI, ScaI)(EcoRV, BamHI, SphI, SlaI, XmaIII, NnuI.)- Có một mảnh operon lacZ, các vi khuẩn chủ yếu sử dụng với pUC dùng để tổng hợp enzyme β-galactosidase.- Có vùng polylinker với 13 vùng giới hạn của 13 enzyme cắt hạn chế.- Ở pUC18, vùng hạn chế (EcoRI, SacI, KnpI, XmaI, BamHI, XbaI, SalI, HindI, AccI, BspmI, PstI, SphI, Hind III).- Ở pUC19, vùng polylinker có trình tự ngược lại (Hind III EcoRI).- Có một gen bền với ampicilline, gen này mã hoá cho protein (enzyme) vốn được tiết ra trong khoảng ngoại biên màng sinh chất của vi khuẩn.Hình: Cấu tạo plasmid pUCSự hiện diện của lacZ tạo thuận lợi cho vector tái tổ hợp bằng cách quan sát các vi khuẩn trên thạch để chọn vi khuẩn có khả năng tiếp nhận một plasmid. Sự có mặt của gen kháng ampicilline cho phép pUC được tiến hành nuôi cấy trên môi trường có ampicillineƯu điểm: Kích thước nhỏ, dễ biến nạp vào tế bào vi khuẩn. Vùng polylinker cho phép gắn xen bất kỳ trình tự DNA lạ nào, hoặc có thể cho phép tạo dòng đoạn DNA có hai đầu dính khác nhau mà không cần chất gắn.4.3.2.2 Plasmid pGEM3 :Hình: Cấu tạo plasmid pGEM3 (Gemini)17Kích thước khoảng 3kb, mang gen kháng ampicilline (AmpR) và vùng polylineker gồm 13 trình tự nhận biết bởi 13 enzymee cắt hạn chế tương tự như vùng polylineker của pUC19.Hai promotor đặc trưng cho RNA-polymerase Sp6 và T7 ở hai bên vùng polylinker. Vì vậy có ưu điểm là cho phép phiên mã đoạn DNA gắn trong vector thành nhiều RNA, mà các RNA này thường được dùng làm mẫu dò, hoặc dùng trong nghiên cứu cấu trúc chức năng của RNA.4.3.2.3 Nhóm các plasmid bluescript:Bluescrip là vector lai nhân tạo phage sợi và plasmid vì vậy nó được kết hợp tất cả những ưu điểm của các phage và ưu điểm của các plasmid, có thể xem đó là nhóm có tiềm năng nhất hiện nay.Cấu tạo: Bluescript có cấu tạo dạng vòng khép kín, kích thước vào khoảng 2.961bp, bao gồm:- Một mảnh lacZ ở đầu 5’ của gen này có cài sẵn polylinker gồm 21 vùng giới hạn: KpnI, ApaI, DraII, XhoI, AccI, HindII, SalI, ClaI, HindIII, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, SpeI, XbaI, NotI, XmaI, SacII, BstXI, SacI hoặc ngược lại. Ở vùng polylinker người ta còn tìm thấy một vùng nhận biết tương đối hiếm (NotI) mà không có ở dãy pUC. Với 2 promoter T3 và T7 để thu được đoạn cài RNA cùng chiều hoặc ngược chiều qua việc sử dụng RNApolymerase của phage T3 nhận biết promoter T3 hoặc ngược lại.- Một mảnh DNA của phage tùy mục đích sử dụng có thể là phage M13 hoặc phage f1.Vùng này sẽ sử dụng khi người ta muốn DNA tái bản dưới dạng sợi đơn hoặc sợi đôi, ngoài ra ở vùng này còn chứa điểm khởi đầu cho sự tái bản (ori). Song sự tái bản chỉ có thể xảy ra bởi sự đồng gây nhiễm với một virus trợ giúp (virus helper). Virus này sẽ bổ khuyết những chức năng thiếu bằng cách mang đến những gen mã hóa các enzyme cần thiết cho sự tái bản. Phụ thuộc vào sự cài đặt của mảnh DNA này so với chiều của gen lacZ, người ta sẽ có vector bluescipt + hoặc −. Cặp này cho phép nhận được sợi cùng chiều hoặc ngược chiều.- Một gen chống chịu được ampicilline, gen này cho phép chọn lựa tất cả những vi khuẩn đã sát nhập một bluescript. Trong vector bluescript còn có điểm khởi đầu sao chép colEI ori, chuỗi này cho phép nhân bản của phagemid (bluenscript) ở trong E. Coli như plasmid. Giống gốc E. Coli được sử dụng thường 18là XL1Blu, trong bộ máy di truyền của chúng có chứa gen mã hóa tổng hợp tetracycline. Điều này cho phép dễ dàng chọn lựa những vector đã sát nhập vào vi khuẩn. Hình: Cấu tạo pBluescript SK (+/-)Ứng dụng: Tùy theo điều kiện thao tác người ta có thể sử dụng bluescript để nhân bản một đoạn DNA sợi đơn hoặc sợi kép hoặc sao chép RNA invitro để sản xuất đầu dò lai hóa hoặc tạo ngân hàng cDNA.4.3 Vector chuyển gen là phagePhage (thực khuẩn thể) là virus xâm nhiễm vi khuẩn làm phân giải vi khuẩn. Việc sử dụng phage làm vector chuyển gen có nhiều ưu điểm hơn so với vector là plasmid:- Dễ xâm nhập vào vi khuẩn.- Khả năng nhân lên nhanh trong tế bào chủ.- Khả năng tiếp nhận đoạn DNA lạ lớn hơn plasmid.Tuy nhiên, việc sử dụng phage có nhiều bất lợi như:- Thao tác ghép DNA lạ phức tạp.- DNA tái tổ hợp không tạo thành khuẩn lạc như DNA tái tổ hợp là plasmid, mà thành đĩa phân giải xuất hiện trên mặt thạch phủ đầy vi khuẩn.19Phần lớn các nhóm phage sử dụng làm vector đều bắt nguồn từ phage λ thuộc thế hệ thứ nhất. Phage λ (thế hệ đầu)Cấu tạo gồm hai phần: Phần đầu chứa DNA và được đóng gói trong vỏ protein. Phần đuôi cho phép virus có thể tự cố định trên các tế bào chủ là vi khuẩn:DNA của phage: Sợi đôi, mạch thẳng, dài 48,5kb gồm hàng chục gen. Đầu tận cùng cuả DNA là sợi đơn gồm 12 nucleotide và chúng được gọi là những đầu dính.Phage sinh sôi nẩy nở theo hai cách:- Chu kỳ tan: phage được sinh sôi nẩy nở trong vi khuẩn. Các phage mới được tạo ra sẽ đi ra khỏi vi khuẩn bằng cách làm tan vi khuẩn này. - Sinh tan: Là một kiểu sinh sản khác của virus, phage không làm tiêu tan vi khuẩn, thay vì tự sinh sản trong tế bào chất, phage sát nhập DNA của mình với DNA của vi khuẩn.Hình: Cấu tạo của phage λHình: Tạo DNA tái tổ hợp204.4 Các vector chuyển gen khác4.4.1. Các cosmid4.4.1.1 Đặc tính cấu tạoCosmid vector được thiết kế để nhân dòng những đoạn ADN lớn (khoảng 40-45 kb). Đây là loại vector nhân tạo kết hợp các thuộc tính của plasmid với phage. Cosmid vector có chứa đầu cos (đầu dính) của phage giúp ADN của phage từ dạng thẳng nối lại thành vòng tròn nên có thể gói bọc dễ dàng trong phần đầu của phage. Mặt khác cosmid vector lại có phần gốc plasmid, do vậy chúng có khả năng tự nhân đôi như những plasmid của vi khuẩn.Do hầu như toàn bộ phần ADN của phage đã được cắt bỏ, nên chúng có khả năng mang đoạn ADN ngoại lai có kích thước lớn. Khi đoạn ADN ngoại lai được ghép nối, các cosmid tái tổ hợp sẽ được gói bọc trong phage. Phage mang ADN tái tổ hợp không tự nhân lên được vì phần ADN phage đã bị loại bỏ nhưng chúng vẫn có khả năng lây nhiễm vào vi khuẩn. Tuy nhiên sau khi vào vi khuẩn, chúng lại có khả năng tự nhân lên do bản thân trong vi khuẩn đã có plasmid bình thường. Cosmid mang đoạn gen lạ có thể dài đến 45 kb dùng để lập thư viện gen ở ruồi giấm, chuột, thậm chí cả ở người.4.4.1.2 Ưu điểm và ứng dụng của cosmidCũng như phage, cosmid cho khả năng xâm nhiễm tế bào vi khuẩn lớn, nhận đoạn cài có kích thước lớn.Hình: Cấu tạo cosmidTrong tế bào chủ, nó tự nhân bản như plasmid. Cho nên người ta nhận được những khuẩn lạc, chứ không phải đĩa phân giải trên mặt thạch, thuận lợi cho việc quan sát.21Với những tiện lợi trên, người ta dùng cosmid để tách dòng từ những gen lớn để tạo ngân hàng genom (bộ gen). Những vi khuẩn mang vector này có khả năng chống chịu với môi trường có ampiciline.Tuy vậy việc ứng dụng cosmid để tách dòng cũng rất khó khăn và vất vả.4.4.2 Các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC(Yeart - Artificial - Chromosomes)Do nhu cầu tạo dòng với những trình tự DNA ngày càng lớn, các nhà nghiên cứu tìm tòi phát triển những vector ngày càng mới. Ngày nay người ta đã tạo ra YAC cho phép tạo dòng với những đoạn DNA dài 150÷1.000kb, trung bình là 350kb. Bằng nghiên cứu cho thấy ở nấm men (Saccharomyces Cerevisiae), nhiễm sắc thể muốn nhân đôi và phân ly tốt cần ba trình tự:- 2 TEL (telomere): Trình tự đầu cuối của NST- CEN (centrmere - tâm động): Trình tự trung tâm của NST, đảm bảo sự chia đôi và đi về 2 cực của tế bào- ARS (autonomously replicating sequence): Trình tự sao chép tự chủ tương tự như ori ở plasmidDựa vào đó người ta đã cấu tạo NST nhân tạo có đủ ba trình tự nói trên với cấu tạo gồm 2 cánh tay, giữa 2 cánh tay người ta có thể cài đặt một đoạn DNA cần tạo dòng với kích thước khoảng 150 đến 1.000kb. Trên mỗi cánh tay gồm các gen đánh dấu di truyền để chọn lọc các tế bào nấm men có chứa YAC và các chuỗi tận cùng có chức năng telomer đoạn cuối của NST. Một trong hai cánh tay mang một mảnh DNA hoạt động như một tâm động và một nguồn tái bản ori. Việc cài DNA lạ vào gen mã hóa chất ức chế tRNA vận chuyển tyrsine sẽ làm biến đổi màu sắc khuẩn lạc tế bào gốc có mang gen hổ phách (khuẩn lạc từ trắng sang đỏ) khi có mặt của DNA lạ. Đây là dấu hiệu về sự hiện diện của YAC tái tổ hợp trong tế bào nấm men.Các nhiễm sắc thể này được đưa vào tế bào chủ (nấm men), nó được nhân lên như NST khác ở trong tế bào nấm men và ta có được những gen mong muốn.225. Các bước tiến hành trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA5.1 Tạo DNA tái tổ hợp5.1.1 DNA tái tổ hợp là gì?DNA gồm 3 thành phần chính: base nitơ dạng purine và pyrimidine (A,T,C,G), đường pentose (đường 5 carbon) và axit phosphoric (H3PO4). Ba thành phần này có tỷ lệ 1:1:1 và chúng liên kết với nhau tạo thành một nucleotide:Hình: Cấu tạo một nucleotideCấu trúc của DNA được Watson-Crick khám phá ra. Đó là chuỗi xoắn kép cong nhẹ nhàng, có cấu trúc không gian 3 chiều, gồm hai sợi song song, đối xứng và bổ sung cho nhau theo một qui luật nghiêm ngặt: A bắt cặp với T và C bắt cặp với G nhờ các liên kết hydro.Với cấu trúc đặc biệt của phân tử DNA và sự bắt cặp nghiêm ngặt của các base nitơ, nhiều nhà nghiên cứu đã nảy ra ý tưởng: nếu tạo ra được những đuôi ở một trong hai sợi của phân tử DNA khác nhau thì chúng có thể nối lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung.Vào những năm 70, người ta đã tạo được những phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên bằng nhiều phương pháp khác nhau.DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là DNA lai - được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ thuật ghép nối các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một loài, hoặc của các loài khác nhau.Ví dụ: Hai vector là plasmid, phage λ được cài mảnh DNA lạ để tạo ra DNA tái tổ hợp. Các DNA lạ này được gọi là đoạn cài hay DNA ngoại lai. Nó chính là 23một mảnh (đoạn) DNA hay là gen mà người nghiên cứu quan tâm và ghép nó vào DNA của plasmid hay DNA của virus.Hình: Mô hình biểu diễn sự tạo ra DNA tái tổ hợp5.1.2 Công đoạn chính tạo DNA tái tổ hợpNăm 1973, Staley Cohen và Annie Chang đã tạo ra những phân tử DNA tái tổ hợp từ các loài khác nhau, có nhiều ưu điểm và đã được biến nạp trong tế bào chủ. Và từ đây, công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời. Sau đó, nhiều nhà khoa học đã lao vào các thí nghiệm lắp ghép gen và nhanh chóng thu được những kết quả có ứng dụng trong thực tiễn.5.1.2.1 Chuẩn bị nguyên liệuNuôi các tế bào vi sinh vật cho vector chuyển gen (thường là DNA plasmid hoặc DNA phage). Tách chiết và làm sạch các vector chuyển genNuôi tế bào cung cấp gen cần chuyển. Sau đó cũng tách chiết và làm sạch các gen này.Ngoài ra, người ta còn sử dụng DNA tổng hợp bằng phương pháp hóa học hoặc tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme sao chép ngượcChuẩn bị các enzyme để cắt, nối các đoạn DNA lại với nhau như enzyme restriction, enzyme ligase cùng với sự hợp tác của một số enzyme khác như kinase và alkanline phosphotase,…5.1.2.2 Công đoạn cắtRE (Restriction Endonuclease) kiểu II: là những enzyme cắt hạn chế ở những vị trí xác định và được dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp bởi vì chúng có một số ưu điểm: Hầu như chỉ có một kiểu hoạt tính cắt, enzyme khác đảm nhiệm việc cải biên. Mỗi một enzyme cắt ở vị trí phù hợp định trước ngay ở bên trong hay cạnh 24trình tự nhận biết. Chúng chỉ cần ion Mg+2 và không cần năng lượng ATP. Các enzyme này gặp chuỗi đích của nó trên phân tử DNA và cắt DNA thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu dínhVí dụ:5.1.2.3 Công đoạn nốiDùng enzyme DNA ligase để nối các đoạn DNA và vector chuyển gen để tạo thành DNA tái tổ hợpDNA ligase là một enzyme xúc tác các phản ứng nối hai mảnh DNA bằng cách tạo cầu nối phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của hai nucleotide đứng cạnh nhau. Trong sinh học phân tử, người ta coi DNA ligase như một chất keo phân tử để kết dính các mẫu DNA lại với nhau.1 - Nối đầu bằng:Nối đầu bằng được xảy ra khi hai đoạn DNA đầu bằng đứng cạnh nhau. Dưới tác dụng của enzyme ligase, liên kết phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) được hình thành và hai nucleotide được nối lại với nhau Khả năng nối hai đoạn DNA đầu bằng rất thấp. Để tăng hiệu suất phản ứng, thường người ta phải tăng nồng độ của các đoạn DNA.2 - Nối đầu lệch:Đầu tiên, hai mảnh DNA đầu lệch do có những base bổ sung nên chúng tiến gần lại nhau để tạo liên kết hydro giữa các base nitơ bổ sung. Sau đó, hai nucleotide của hai đầu nối tạo liên kết este giữa OH(3’) và P(5’) dưới tác dụng của enzyme DNA ligase.25 |
