Nguyên nhân sai lầm của phương pháp nhuộm wright

NHUỘM DIFF - QUICK

NGUYÊN TẮC

Là phương pháp nhuộm dựa trên sự cải biên của phương pháp nhuộm Wright Giemsa của Bernard Witlin năm 1970. Nó có ưu điểm hơn phương pháp nhuộm Wright Giemsa, vì các bước nhuộm đơn giản hơn, ít tốn thời gian hơn và cho phép tìm bạch cầu ái toan hay ái kiềm bằng cách thay đổi thời gian nhuộm. Vì vậy, nó là phương pháp nhuộm nhanh tế bào và mô, được áp dụng cho nhiều loại bệnh phẩm, từ chọc hút kim nhỏ, phiến đồ tế bào học bong, phiến đồ tế bào học áp, tinh dịch đồ. Phiến đồ nhuộm Diff - Quik cần để khô trong không khí trước khi cố định, không cố định khi phiến đồ còn ướt. Phương pháp nhuộm này giúp đánh giá chi tiết bào tương tế bào, các giọt lipid, các hạt chế tiết, chất nhầy, các chất ngoại bào như chất nhầy, các sợi keo. Các thành phần như vi khuẩn, nấm cũng dễ dàng phát hiện được bằng phương pháp nhuộm này.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học:                      02

Phương tiện, hóa chất

Dung dịch cố định phiến đồ: metanol khan (bán sẵn).

Cồn 95o.

Cồn tuyệt đối.

Xylen.

Nước cất

Phẩm nhuộm Diff-Quick (bán sẵn).

Lá kính.

Bôm Canada.

Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).

Kính hiển vi quang học.

Phiếu xét nghiệm.

Nguồn cấp nước chảy.

Găng tay các loại, khẩu trang, áo choàng y tế.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Cố định: 20 giây

Gắn lá kính bằng bôm Canada

KẾT QUẢ 

Hồng cầu: màu hồng/vàng đỏ.

Tiểu cầu: màu tím/hạt màu tím.

Bạch cầu đa nhân trung tính: nhân màu xanh, bào tương màu hồng tím.

Bạch cầu ái toan: nhân màu xanh, bào tương màu xanh, các hạt màu đỏ.

Bạch cầu ưa kiềm: nhân màu tím hoặc xanh đen.

Bạch cầu đơn nhân: nhân màu tím, bào tương xanh sáng.

Vi khuẩn: màu xanh.

NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

Nếu phiến đồ nhuộm Diff - Quik chưa để khô mà cố định ngay sẽ làm mật hết các hạt trong bạch cầu ái kiềm, hình thành các hạt giả, dẫn đến nhầm lẫn khi nhận định.

Cố định không đầy đủ có thể làm chi tiết nhân không rõ ràng hoặc mất các hạt, nhất là với bạch cầu ưa kiềm và các tế bào dòng tủy của máu.

Phiến kính không sạch sẽ dẫn tới những nhận định sai, nhất là vi khuẩn.

Nếu có vấn đề về cố định chưa tốt hoặc cần nhận rõ các hạt trong tế bào, cần tăng thời gian cố định lên 1 phút.

Chỉ sử dụng metanol khan để cố định và các phiến đồ cần giữ kín, tránh ẩm.

Nếu màu hồng tăng quá mức là do thời gian nhuộm ngắn hoặc rửa kéo dài hoặc độ pH của phiến đồ thấp.

Chỉ sử dụng nước cất hoặc nước muối đệm photphat cho bước rửa cuối. Không được sử dụng nước máy, vì có thể làm xáo trộn sự cân bằng acid cơ bản và có thể chứa clo.

Rửa dưới áp lực nước cao sẽ làm trôi mất tế bào hoặc vón cục bệnh phẩm. Vì vậy, cần rửa dưới vòi nước chảy nhẹ. Rửa nước không đủ sẽ có cặn thuốc trên phiến đồ.

Giữa các bước nhuộm, không được để phiến đồ bị khô.

Không sử dụng phẩm nhuộm khi đã hết hạn sử dụng, do vậy, cần kiểm tra hạn dùng của phẩm nhuộm trước khi tiến hành nhuộm.

Gustav Giemsa sinh ra ở Đức vào năm 1867, làm việc chủ yếu như nhà hóa học và mất năm 1948. Phương pháp nhuộm mang tên ông ban đầu được thiết kế chủ yếu để xác định ký sinh trùng sốt rét. Tuy nhiên, nó cũng được sử dụng trong mô học vì có thể nhuộm nhiễm sắc thể và màng nhân với chất lượng tốt. Hơn nữa, một số thành phần tế bào sẽ bắt mầu nhuộm khác nhau. Đặc biệt là chất lượng nhuộm tế bào chất sẽ khác nhau phụ thuộc vào kiểu tế bào. Việc sử dụng methylene azure và hỗn hợp của nó với xanh methylene để hình thành nên một eosinate tạo màu thuốc nhuộm bền vững. Nhuộm Giemsa được coi là kỹ thuật chẩn đoán chuẩn của thế giới cho ký sinh trùng sốt rét, và nó cũng là phương pháp nhuộm cơ bản cho phân loại ung thư lympho trong phân loại Kiel.

Lịch sử kỹ thuật nhuộm mô tế bào

Việc sử dụng thuốc nhuộm đầu tiên trong nghiên cứu dưới kính hiển vi có vẻ bắt đầu từ năm 1770 bởi Hill. Ông đã sử dụng màu son đỏ (marmine) trong nghiên cứu của mình về gỗ. Trong năm 1838, Ehrenberg đã sử dụng bột chàm và son đỏ cho xét nghiệm các sinh vật sống. Đáng chú ý, kỹ thuật Ehrenberg vẫn được sử dụng để chứng minh khả năng của các động vật nguyên sinh hấp thụ các mảnh thức ăn.

Việc sử dụng thực tế các thuốc nhuộm sinh học được thực hiện bởi J. Gerlach vào năm 1858. Ông đã tiêm chất keo (gelatin) của son đỏ được chuẩn bị thô vào mô và mô tả việc chuẩn bị của ammoniac carmine. Bởi vậy ông là người đầu tiên sử dụng ammonium carminate và nhìn chung được xem là cha đẻ của kỹ thuật nhuộm.

Sự tiến bộ đến nhanh chóng trong kỹ thuật nhuộm đã đạt được sau khi Gerlach chỉ ra con đường đầu tiên. Indigo lần đầu tiên được sử dụng bởi Maschke (1859). Vào năm 1866, Schweiger-Seidel và Dogiel giới thiệu một sự kết hợp của carminate và acetic acid. Hematoxylin được sử dụng như thuốc nhuộm mô bởi Böhmer (1865). Thành công của ông do sử dụng tinh thể hematoxylin kết hợp với nhôm, có lẽ bởi vì ông biết rằng nhôm thường được sử dụng như một chất trong nhuộm vải. Nhuộm kép được giới thiệu bởi Schwartz (1867), người mà khuyên nhuộm mô với ammonium carminate pha loãng sau đó bởi dung dịch picric acid. Một năm sau đó, Ranvier (1868) lần đầu tiên sử dụng thuốc nhuộm prcrocarrmine trong một bước duy nhất.

Thuốc nhuộm Anilin được sử dụng từ năm 1856, kiểu đầu tiên là mauveine (được chuẩn bị bởi Perkin). Fuchsin (đầu tiên được gọi là đỏ anilin) và các biến thể của nó được sử dụng bởi Beneke (1862) và Waldeyer (1863). Nguyên lý của sự biệt hóa sau nhuộm được sử dụng vào năm 1869 bởi Böttcher và sau đó được sử dụng bởi Hermann (1875) và vào năm 1881 được mô tả thêm bởi Flemming. Bởi vậy, quy trình nhuộm phát triển theo một cấp số nhân với sự phát triển của nhiều kỹ thuật và sự kết hợp giữa chúng.

Nhuộm Giemsa

Gustav Giemsa sinh ra ở Hamburg, Đức vào năm 1867. Ông làm việc chủ yếu như một nhà hóa học và áp dụng khả năng của ông vào nghiên cứu y học và vi sinh. Ông đã viết tất cả công trình của ông bằng tiếng Đức, các bài báo chính được xuất bản trong những năm đầu của thế kỷ trước. Ông mất năm 1948. Phương pháp nhuộm mà mang tên ông được thiết kế chủ yếu cho chứng minh ký sinh trùng sốt rét và sau đó được cải tiến cho nhuộm xoắn khuẩn giang mai (reponema pallidum).

Ký sinh trùng sốt rét (động vật nguyên sinh thuộc chi Plasmodium) đã được phát hiện vào năm 1880 bởi Frech Laveran, lúc đó ông làm việc ở Algier. Những năm sau đó, Laveran nhận được giải thưởng Nobel cho sự đóng góp của ông. Vào năm 1888, Chenzinsky phát minh ra một hỗ hợp eosin với sự dư thừa của xanh polychrome methylene để hòa tan chất kết tủa , với sự trợ giúp của cồn 30%. Vào năm 1889, Malachowski sử dụng cải biến dung dịch của Chenzinsky để thu được màu nhuộm đỏ tím của nhân bạch cầu và nhân của ký sinh trùng sốt rét. Romanowsky sử dụng một quy trình tương tự vào năm 1890 để thu được kết quả tương đương, nhưng không phương pháp nào có thể lặp lại. Xung quanh năm 1889, Jenner chuẩn bị một dung dịch Eosinate xanh methylene đơn giản với methanol, dung dịch này dùng cả như chất cố định và (sau đó pha loãng với nước) như một tác nhân nhuộm mà lặp lại kết quả nhuộm của Chenzinsky. Phương pháp May-Grünwald năm 1902 về cơ bản giống như mô tả của Jenner.

Năm 1886, Bernthsen chuẩn bị một thuốc nhuộm tương đối tinh khiết, được nhận bởi sự ô xi hóa xanh polychrome methylene và được gọi là Methylene azure. Sự lựa chọn may mắn của Giemsa về methylene azure của Bernthsen và việc bổ sung xanh methylene để tạo nên eosinate của ông ấy thay cho polychrome methylene blue eosinate kiềm đã được sử dụng trước đây tạo kết quả ổn định. Tới nay, nhuộm Giemsa được coi như kỹ thuật chẩn đoán chuẩn cho ký sinh trùng sốt rét. Nó cũng có thể chứng minh các dạng vi sinh vật khác như: Histoplasma, Leishmania, Toxoplasma, and Pneumocystis. Giemsa đã nhận xét khi về già rằng ông được nhớ đến vì phương pháp nhuộm của mình, ông cũng ước tính đó là một thành tựu rất nhỏ, chứ không phải vì những đóng góp quan trọng của ông đối với y học nhiệt đới.

Nhuộm Giemsa được làm phù hợp với mô học từ vi sinh học bởi vì nhuộm nhiễm sắc thể chất lượng cao và màng nhân rõ ràng của tất cả tế bào, một số thành phần tế bào bắt màu khác nhau (ví dụ, các hạt tế bào chất của những tế bào lớn), và chất lượng màu nhuộm tế bào chất khác nhau phụ thuộc vào kiểu tế bào. Do đó, trong quá trình phát triển sớm của nghiên cứu hiển vi, nhuộm Giemsa được sử dụng (chủ yếu ở Châu Âu) để mô tả các đặc tính nhuộm và cấu trúc của kiểu mô tế bào khác nhau. Nó được biết đến để cung cấp các chi tiết sắc nét của tuyến tụy nội tiết, tuyến sinh dục nam, tuyến thượng thận (nhuộm thể vùi tế bào chất), và các sợi tuyến ngoại tiết và tuyến bã.

Nhiều nhà nghiên cứu đã phát triển cải tiến phương pháp của Giemsa để đạt được kết quả tốt hơn, chủ yếu nhằm giúp đơn giản hóa kỹ thuật và tăng giá trị của xanh methylene như màu nhuộm chính.

Nhuộm Giemsa bao gồm 2 quy trình, một cho máu hoặc vi sinh vật trong vết kéo mẫu (smear) và một quy trình khác cho các lát cắt mô. Nhìn chung, nhuộm máu thông thường có nghĩa là việc sử dụng một thuốc nhuộm phức hợp được tạo thành bởi sự liên kết hóa học của một thuốc nhuộm acid và một bazo (thông thường là một hợp chất của eosin-xanh methylene). Muối natri của một thuốc nhuộm acid (ví dụ eosin) và chloride của một bazo (ví dụ xanh methylene) có thể được chuyển bởi chuyển đổi đơn giản thành sodium chloride với thuốc nhuộm phức hợp (ví dụ xanh methylen eosinate), chất sau không tan trong nước trừ khi có dư thừa hoặc thuốc nhuộm acid hoặc bazo. Nhuộm máu đầu tiên được phát triển bởi Ehrlich vào năm 1879 bởi sử dụng dung dịch xanh methylene và fuchsin acid, một phương pháp mà có thể chứng minh các hạt của bạch cầu trung tính. Ông sau đó đã cải tiến phương pháp nhuộm này bởi thêm Orange G và thay xanh methylene với methy green để tạo thuốc nhuộm triacid của mình, cái mà vào năm 1888 trở thành thuốc nhuộm Ehrlich-Biondi-Heidenhain.

Trong công trình của ông, Giemsa phát triển một sản phẩm oxi hóa bí mật của xanh methylen mà ông đặt tên là Azure I (một tên thương mại được áp dụng với dung dịch) và được xem như một thuốc nhuộm tinh khiết; tuy nhiên, Azure I dường như là một hỗn hợp biến đổi của Azure A và Azure B. Cả thuốc nhuộm (Azure A và Azure B) là biến thể của xanh methylene, là hỗn hợp của các thuốc nhuộm và không phải là một thuốc nhuộm đơn giản, và 3 kiểu thuốc nhuộm Azure có mặt trong hỗ hợp: A, B, C. Giemsa cũng chuẩn bị Azure II, một hỗn hợp của Azure I với một lượng tương đương của xanh methylene. Sau hướng dẫn của ông, công ty Gruber của Đức đã giới thiệu sản phẩn Azure II trên thị trường. Các công ty khác bán sản phẩm với tên tương tự, nhưng không phải tất cả chúng là giống hệt với dung dịch Giemsa gốc. Sau khi nhận Azure I, Giemsa kết hợp nó với Eosin để nhận một hợp chất xác định hơn khi polychrome methylen blue được sử dụng. Hơn nữa, để nhận được sự biệt hóa tốt hơn, ông trộn nó với xanh methylene. Công ty Gruber phát triển một hợp chất được gọi là Azure-II-Eosin, nó là một eosinate của Azure II. Azure B là thành phần quan trọng của nhuộm Giemsa. MacNeal có thể đã đúng trong việc lựa chọn Azure A và tím methylene như những chất quan trọng của nhuộm máu thường quy nhưng sai lầm trong việc sử dụng hỗn hợp tương tự cho nhuộm động vật nguyên sinh trong máu. Vì Giemsa nhấn mạnh, một tỷ lệ xác định của xanh methylene được yêu cầu để thu được màu nhuộm thích hợp của tế bào chất của plasmodia, hoặc các ký sinh trùng khác và tế bào lympho.

Các nghiên cứu sâu hơn nữa về bản chất hóa học của dung dịch Giemsa và xanh methylene được thực hiện bởi Bernthsen và Kehrmann (1906), MacNeal (1906), và Holmes French (1926).

Phương pháp Giemsa được coi là nhuộm đa màu, điều này nghĩa là một lần nhuộm trong cùng lát cắt mà tạo ra nhiều màu khác nhau đối với các thành phần của mô, những màu này không giống kết quả nhận được khi sử dụng hỗ hợp các màu để nhuộm.

Nhuộm Giemsa với vết kéo mẫu (smear) sử dụng lam được làm khô trong không khí mà sau đó chuyển nhanh qua methyl alcohol được nhuộm với dung dịch Giemsa gốc trong khoảng 15 phút. Sau mô tả ban đầu của Giemsa, Romanowsky đã xuất bản một báo cáo chi tiết về quy trình nhuộm vết kéo mẫu (smear) sử dụng nhuộm Giemsa.

Phương pháp nhuộm mô Giemsa như được báo cáo bởi chính ông sử dụng hơi cồn (sublimated alcohol) như một chất cố định, sau đó bởi nhúng trong paraffin. Lát cắt mô sau đó được xử lý với dung dịch iodum và dung dịch hyposulfite, rửa mạnh với nước cất, và được nhuộm với dung dịch Giemsa (mới pha loãng) trong 2 tới 12 giờ. Các lát cắt sau đó được rửa trong nước cất và tiếp theo được rửa trong dung dịch acetone/xylol, xylene tinh khiết, và credrum essence và cuối cùng được gắn với Canada balsam. Romeis đã đề nghị dung dịch Giemsa của Grüber. Trong suốt thập kỷ đầu tiên của thế kỷ trước, thuốc nhuộm Giemsa của Đức được ưa chuộng trên toàn thế giới, có lẽ bởi vì ưu điểm nhận được từ thành phần bí mật chưa được biết của Azure I. Trong chiến tranh thế giới thứ II, thiếu sự sẵn có của sản phẩm Đức gây áp lực lên việc sử dụng dung dịch nhuộm Giemsa của Mỹ, và một số mẫu hoàn toàn đạt yêu cầu. Sau đó và hiện tại, nhiều công ty sản xuất dung dịch Giemsa với kết quả đạt yêu cầu.

Một trong những cải tiến đầu tiên của nhuộm Giemsa được thực hiện bởi Pappenheim, người mà phát triển thuốc nhuộm May-Giemsa (cũng được gọi nhuộm panoptic), cái mà được kiểm tra với cả mô và vết kéo mẫu (smear). Nhuộm Giemsa đối với vết kéo mẫu cần cố định trong methyl alcohol trong 3-5 phút, ngược lại với quy trình MayGrünwald, mà chứa alcohol trong dung dịch nhuộm. Giemsa đã tự thực hiện và báo cáo những gì ông ấy gọi là phương pháp nhanh cho nhuộm, cải tiến dung dịch nhuộm bởi thêm một chất cố định (methyl alcohol hoặc các cồn nồng độ cao khác (high-grade alcohol). Romeis nhận xét rằng hai cách nhuộm quan trọng nhất đối với vết kéo mẫu (smear) là phương pháp May-Grünwald và Giemsa và sự kết hợp của chúng; tuy nhiên, hai cách nhuộm máu mà có nhu cầu lớn ở Bắc Mỹ là nhuộm Wright và nhuộm Giemsa.

Bị ám ảnh bởi ham muốn của mình để hoàn thiện phương pháp, Giemsa đã xuất bản một tóm lược về khả năng của khả năng thất bại và nguyên nhân của nó. Ví dụ, nhuộm chính xác dẫn đến nhuộm màu tím đỏ nhạt của nhiễm sắc thể, và màu này chỉ nhận được nếu dung dịch chuẩn bị được xử lý trong một môi trường trung tính.

Giemsa cũng phát triển một chất cố định được biết là thăng hoa ăn mòn (orrosive sublimate) (được làm từ 2 phần của dung dịch nước bão hòa của tinh dầu ăn mòn và 1 phần cồn tuyệt đối) và một thuốc nhuộm cho các hạt nhiễm sắc sau cố định dichromate, cái mà được sử dụng cho nhuộm các hạt thượng thận.

Gustav Giemsa, là một nhà hóa học cơ bản, bác bỏ phân loại của Ehrlich về màu nhuộm anilin (được báo cáo 1877) và đề xuất nhóm thành acid chrome, basic chromes, và ampjo chromes. Như một ví dụ, hợp chất dựa trên ammonium picrate là thuốc nhuộm acid-chrome (ví dụ, Eosin, đỏ Công, auracin, light green, acid fuchsin); một chất màu cơ bản và một hợp chất acid trung lập hình thành một thuốc nhuộm basic-chrome (ví dụ, methyl violet, fuchsin, tionin, gentiana violet, xanh methylene); và thuốc nhuộm ampho-chrome là muối mà do sự kết hợp của thuốc nhuộm basic và một thuốc nhuộm acid (ví dụ picric rosanilin).

Trong bệnh lý học, nhuộm Giemsa chủ yếu được sử dụng trong bệnh lý về máu, mặc dù nó cũng được sử dụng bởi một số trong chứng minh sự có mặt của Helicobacter pylori trong sinh thiết dạ dày và cho chứng minh tế bào mast.

Việc sử dụng nhuộm Giemsa trong bệnh lý về máu đầu tiên được công nhận trong vết kéo máu (blood smear), chỉ hoặc trong kết hợp với nhuộm May-Grünwald. Các đặc tính nhuộm của kỹ thuật này cho phép xác định các kiểu tế bào bạch cầu hạt và các loại tế bào máu khác, cung cấp chi tiết nhân tốt, và bộc lộ tế bào chất bazo hoặc acid rất tốt của các tế bào ung thư biểu mô và bạch cầu tủy.

Karl Lennert và nhóm của ông từ Kiel đã xuất bản nhiều bài báo và sách trong đó họ tán dương ưu điểm của nhuộm Giemsa đối với mô hematolymphoid. Thực vậy, phân loại của Kiel về u lympho dựa trên nghiên cứu các lam kính nhuộm Giemsa, một quy tình mà được xem là tốt hơn so với hematoxylin và eosin trong phân tích hạch bạch huyết và tủy xương. Cần phải đề cập đến rằng nhuộm nhân là không rõ với nhuộm Giemsa như khi nhuộm với hematoxylin eosin; tuy nhiên, nhuộm tế bào chất khác biệt, đặc biệt các hạt được biệt hóa (ví dụ, đặc tính nhuộm bào quan khác nhau ở tế bào mast, đỏ trong bạch cầu ái toan, bắt màu bazo đối với tế bào plasma), là tốt hơn với những gì nhận được từ hematoxylin eosin.

Gần đây, nhuộm Giemsa đang dần bị bỏ rơi, và các nhà bệnh lý học trẻ không quen với nó và kết quả của nó. Dưới đây chỉ là một ví dụ của xu hướng này, gần đây hơn viện nghiên cứu bệnh lý học của quân lực về hạch bạch huyết và bệnh lách không có một bức ảnh nào về lát cắt mô được nhuộm Giemsa, mặc dù có những bức ảnh về nhuộm Giemsa với vết kéo mẫu (smear).

Trong số những nhân tố mà chịu trách nhiệm cho xu hướng này, có lẽ quan trọng nhất là đánh giá hình thái thuần túy của hạch bạch huyết và tủy xương bị đánh giá thấp, giả định rằng hóa mô miễn dịch và nghiên cứu phân tử là cần thiết cho một chẩn đoán đặc biệt thậm chí nếu chẩn đoán hình thái chắc chắn được thực hiện. Trong bất cứ sự kiện nào, trong trung tâm bệnh lý học chất lượng tốt nhất, các lam nhuộm thường quy vẫn được kiểm tra kỹ càng trước khi chúng được phân tích bằng các kỹ thuật phức tạp hơn.

Nhược điểm quan trọng nhất của nhuộm Giemsa là rằng nó biến mất nhanh, đặc biệt nếu tiếp xúc với ánh sáng; bởi vậy, lam không phải là vĩnh cửu và có thể không được xem lại được sau một khoảng thời gian, phụ thuộc vào loại Giemsa gốc được sử dụng.

Theo như các khía cạnh kỹ thuật được quan tâm, chuẩn bị các lam kính thích hợp là cực kỳ quan trọng cho phân tích hiển vi. Không phải hiếm khi quan sát các lát quá dầy mà nhuộm màu đậm quá hoặc biệt hóa kém và rằng bởi vậy không thể chấp nhận cho quan sát. Đương nhiên, loại chất phản ứng và các sản phẩm được sử dụng trong việc nhuộm cũng ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng.

Tóm lại, nhuộm Giemsa là một phương pháp nhuộm rất phong phú về mặt mô học, khả năng áp dụng, và kết quả đẹp. Không may thay, nhiều nhà bệnh lý học trẻ không đánh giá cao khả năng của nó, và phương pháp nhuộm này đang bị dần loại bỏ trong thực hành hàng ngày. Ở đây chúng tôi có gắng bảo vệ một phương pháp nhuộm truyền thống mà có thể vẫn đóng góp lớn với thực hành chẩn đoán bệnh và đưa tới cơ hội chiêm ngưỡng ảnh hiển vi cực đẹp.