Thực tế có nhiều cách để xác định loại vi khuẩn, trong đó nhuộm gram là phương pháp được sáng chế năm 1884 và vẫn có giá trị cho đến ngày nay để phân loại vi khuẩn nhanh thành 2 nhóm lớn với đặc tính riêng biệt. Nhuộm gram là phương pháp dựa trên đặc tính lý hóa của thành tế bào mà phân loại vi khuẩn thành 2 loại là vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương. Nhuộm gram có thể được thực hiện trên cả dịch cơ thể hoặc trên mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn. Nhuộm gram là phương pháp xác định loại vi khuẩn nhanh hơn nuôi cấy có ý nghĩa giúp phân biệt sớm các bệnh do nhiễm khuẩn để xác định hướng điều trị cũng như tiên lượng bệnh. Các thuốc thử cần sử dụng cho phương pháp này gồm có:
 Nhuộm gram có thể xác định được loại vi khuẩn gram âm hay gram dương nhanh hơn phương pháp nuôi cấy Quy trình nhuộm gram sẽ gồm các bước sau:
Vi khuẩn có đặc điểm là lớp peptidoglycan dày ở thành tế bào giúp giữ các phức hợp tím tinh thể nên sau khi nhuộm gram sẽ bắt màu tím sẫm Gentian và không bị tẩy màu sau dùng cồn tẩy 950. Những vi khuẩn này sẽ được phân loại là vi khuẩn gram dương như: tụ cầu, phế cầu, liên cầu,... Vi khuẩn có lớp peptidoglycan mỏng hơn và có thêm lớp màng lipopolysaccharide bên ngoài không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể-iod và sẽ bị khử màu. Sau đó khi dùng dung dịch Fuchsin 1/10 phủ lên thì những vi khuẩn này sẽ bắt màu đỏ hoặc hồng. Các vi khuẩn này sẽ được phân loại là vi khuẩn gram âm. Như vậy có thể thấy bước tẩy màu rất quan trọng và cần phải có kỹ năng nhất định vì khả năng bắt màu của Gram dương không phải là tuyệt đối. Vi khuẩn tụ cầu được phân loại là vi khuẩn gram dương sau khi nhuộm gram Vi khuẩn gram dương giả do các yếu tố sau:
Vi khuẩn gram âm giả do các nguyên nhân như không thay Lugol hoặc tẩy cồn quá lâu và không tráng kỹ. XEM THÊM:
Sự khác nhau giữa vi khuẩn và virus XEM THÊM: QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHUỘM GIEMSA QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHUỘM GIEMSA I. NGUYÊN LÝ Tế bào được dàn mỏng và cố định trên lam kính bằng cồn tuyệt đối. Màng, nguyên sinh chất, các đặc hiệu trong nguyên sinh chất, nhân của tế bào sẽ bắt mầu đặc hiệu với thuốc nhuộm Giemsa. II. CHỈ ĐỊNH Tiêu bản máu, tiêu bản chất dịch (dịch phế quản, dịch các màng , dịch ổ bụng...) III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH Không có chống chỉ định IV. CHUẨN BỊ 1. Người thực hiện KTV khoa Huyết học – Truyền máu 2. Bệnh phẩm - Tiêu bản cần nhuộm được đánh dấu: Tên bệnh nhân, khoa phòng. - Tiêu bản để khô. 3. Chuẩn bị phương tiện, hóa chất: - Phương tiện: + Bút chì kính + Khay men + Ống đong các cỡ: 10ml, 20ml + Pipet nhỏ giọt + Đũa thủy tinh + Giá nhuộm, giá cắm + Đồng hồ - Hóa chất: + Cồn tuyệt đối + Thuốc nhuộm Giemsa mẹ: - Nhuộm thường quy (dung dịch giemsa 3- 4%): Pha 9,7 ml nước cất với 0,3 ml Giemsa mẹ, khi nhuộm để 30 – 45 phút. + Nước cất. 4. Phiếu xét nghiệm Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán. V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH - Cố định tiêu bản giọt đàn, tiêu bản chất dịch bằng cách tay trái cầm tiêu bản nghiêng 30 độ,tay phải cầm pipet nhỏ 3- 4giọt cồn tuyệt đối lên phần đầu của tiêu bản. Dùng pipet gạt ngang cho cồn tràn phủ khắp diện tích mẫu bệnh phẩm, vừa gạt vừa nghiêng tiêu bản cho cồn chảy hết về đuôi của tiêu bản. Cắm tiêu bản lên giá cho khô. - Đối với tiêu bản giọt đặc quá dày hoặc bị bẩn thì phải dung giải bằng cách nhỏ nước cất hoặc dung dịch Giemsa 1% kín giọt máu, để 1- 2 phút, đổ nước đi rồi cắm tiêu bản lên giá cho khô. - Xếp tiêu bản lên giá, nhỏ giọt dung dịch thuốc nhuộm phủ kín diện tích mẫu bệnh phẩm, để thời gian đúng với quy định. - Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ, không đổ thuốc nhuộm trước, không để nước xối trực tiếp vào giọt máu, để tiêu bản khô tự nhiên. VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ - Soi kính hiển vi, nhận định kết quả và nhận xét tiêu bản nhuộm. V. SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ - Khi nhuộm tiêu bản bị bong bệnh phẩm do cố định cồn không tốt - Tiêu bản kéo quá dầy khó nhận định được hình thái tế bào - Tiêu bản nhuộm bị mờ không rõ hình thái tế bào do pha thuốc nhuộm không đúng tỷ lệ
Thành viên thử việc
E không rõ ạ: 1. Tại sao khi cố định cồn nên để nghiêng tiêu bản chứ không nên để ngay tiêu bản ạ? 2. Tại sao phải để khô tự nhiên tiêu bản rồi mới cố định cồn và cũng để khô tiêu bản trước khi nhỏ tiếp thuốc nhuộm? 3.Mọi người có thể hướng dẫn và chia sẽ kinh nghiệm giúp e cách phân biệt các loại bạch cầu được không ạ? Vì khi e đọc tài liệu và một số bài viết trên diễn đàn thì thế nhưng thực tế e thấy vẫn còn khó phân biệt lắm,đặc biệt là bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu ưa acid,có thể nói qua về hạt nhân và hạt bào tương của hai loại này giúp e với vì thực tế e thấy màu của 2 loại này khá giống nhau,kể cả bào tương hay hạt nhân. E cảm ơn ạ!
Administrator
(10-15-2013, 06:02 PM)van hmu Đã viết: E không rõ ạ: 1. Tại sao khi cố định cồn nên để nghiêng tiêu bản chứ không nên để ngay tiêu bản ạ? 2. Tại sao phải để khô tự nhiên tiêu bản rồi mới cố định cồn và cũng để khô tiêu bản trước khi nhỏ tiếp thuốc nhuộm? 3.Mọi người có thể hướng dẫn và chia sẽ kinh nghiệm giúp e cách phân biệt các loại bạch cầu được không ạ? Vì khi e đọc tài liệu và một số bài viết trên diễn đàn thì thế nhưng thực tế e thấy vẫn còn khó phân biệt lắm,đặc biệt là bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu ưa acid,có thể nói qua về hạt nhân và hạt bào tương của hai loại này giúp e với vì thực tế e thấy màu của 2 loại này khá giống nhau,kể cả bào tương hay hạt nhân.1. Để nghiêng để cồn chảy nhanh qua làm tiêu bản nhanh khô hơn và tránh bong tiêu bản. 2. Mục đích của việc cố định là đẩy hết nước ra khỏi tế bào, vì vậy tiêu bản để khô trước khi cố định để việc cố định tốt hơn, còn sau đó phải để khô để tránh bong tiêu bản khi nhuộm. 3. Để phân biệt các loại bạch cầu, trước hết khi quan sát một tế bào bạn để ý phần nhân trước xem chia đoạn hay không chia đoạn để phân ra nhóm bạch cầu đoạn (tt, acid, base) và nhóm đơn nhân (mono, lypho, stab...). Với nhóm bạch cầu đoạn bạn tiếp tục nhìn vào phần tế bào chất. bạch cầu hạt trung tính có các hạt đặc hiệu màu hồng, nhỏ, mịn. Còn ưa acid màu vàng cam. 2 màu này khác nhau rõ mà. Với nhóm đơn nhân bạn phải dựa vào kích thước, hình dạng tế bào, hình dạng nhân để phân biệt...
Thành viên thử việc
Dạ nhưng thực tế em thấy màu bào tương của bạch cầu ưa acid với bạch cầu trung tính tương đối giống nhau,ko hẳn là màu cam theo lý thuyết đâu ạ? E thấy thầy cô cũng bảo vậy
Old Moderator
nhìn vào nhân với Kt nữa. acid thì nhân giống hình gọng kính và kt to hơn neutrophile, hạt nhiếm sắc thì to hơn và bắt màu vàng cam
Administrator
(10-17-2013, 01:50 AM)van hmu Đã viết: Dạ nhưng thực tế em thấy màu bào tương của bạch cầu ưa acid với bạch cầu trung tính tương đối giống nhau,ko hẳn là màu cam theo lý thuyết đâu ạ? E thấy thầy cô cũng bảo vậy Cũng không hẳn cam rõ, nhưng chắc chắn có sự khác biệt. Có thể do hóa chất em dùng không tốt nên bắt màu không rõ. Em có thể chuyển qua nhuộm 2 thì xem sao? Em nhuộm giemsa gốc 1 phút, rửa nước, rồi nhuộm giemsa 10% trong 10 phút. Một lưu ý nữa là nước dùng để pha giemsa 10% em nên dùng nước đệm (pH khoảng 7,4). Các hạt ưa acid nó to và rõ hơn các hạt trung tính cũng là một điẻm để em phân biệt.
Thành viên thử việc
thực sự em thấy rất khó ạ như trong lập công thức bạch cầu ngoài việc phải phân biệt được các loại BC ưa acid, baso, trung tính, lympho, mono mình còn phải phân biệt với các tế bào khác mà bình thường k có trong máu ngoại vi như hồng cầu non, tương bào, tế bào plast, ..... cho e hỏi khi lập công thức BC nếu thấy các tb khác như vậy thì chúng ta đếm chúng vào tế bào khác ạ và k tính ra tỷ lệ % ?
Administrator
(10-18-2013, 01:51 AM)huyền đỗ Đã viết: thực sự em thấy rất khó ạ như trong lập công thức bạch cầu ngoài việc phải phân biệt được các loại BC ưa acid, baso, trung tính, lympho, mono mình còn phải phân biệt với các tế bào khác mà bình thường k có trong máu ngoại vi như hồng cầu non, tương bào, tế bào plast, ..... cho e hỏi khi lập công thức BC nếu thấy các tb khác như vậy thì chúng ta đếm chúng vào tế bào khác ạ và k tính ra tỷ lệ % ? Đếm chúng vào tế bào khác nhưng phải tính %, nếu có điều kiện có thể trả cụ thể là tế bào dòng gì.
Nhân viên chính thức
thầy cho em xem hình ảnh của hồng cầu non với ạ hướng tới tương lai
Old Moderator
#9 10-20-2013, 05:58 PM (Sửa đổi lần cuối: 10-20-2013, 06:03 PM bởi phuhmtu.)hồng cầu non thì tương tự như nguyên hc ưa acid ý, nó vẫn còn nhân nên máy sẽ đếm nhầm sang lymphocyte hình như này chẳng hạn
xem hình hồng cầu ở đây http://www.chronolab.com/hematology/2_2_4.htm
Nhân viên chính thức
cám ơn thầy ạ hướng tới tương lai |
