Tạo chồi là gì

Ở phần I có giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy mô và lợi ích từ của nuôi cấy mô. Phần II giới thiệu thêm các thành phần trong môi trường nuôi cấy, phần II-a, giới thiệu thêm các thành phần bổ sung vào môi trường như bột chuối, nước dừa, than hoạt tính, yeast extract, agar… trong phần II-b sẽ giới thiêu các loại hormone bổ sung vào môi trường nuôi cấy.

Nội dung bài viết sẽ được trình bày như sau:

1. Nuôi cấy mô thực vật và lợi ích từ nuôi cấy invitro phần I
2. Nuôi cấy mô thực vật và thành phần môi trường nuôi cấy invitro phần II
3. Nuôi cấy mô thực vật và các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy phần II-a
4. Nuôi cấy mô thực vật và môi trường bổ sung các loại hormone phần II-b
5. Nuôi cấy mô thực vật và các loại kháng sinh trong môi trường nuôi cấy phần II-c
6. Nuôi cấy mô thực vật và các kỹ thuật nuôi cấy mô phần III

GIỚI THIỆU CÁC LOẠI HORMONE BỔ SUNG VÀO MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THỰC VẬT

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây:

a. Nhóm các auxin

Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: 1H- indole-3-acetic acid (IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA). IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật; còn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin-oxydase) không có tác dụng.

Những auxin có hiệu lực riêng biệt trong nuôi cấy tế bào thực vật là 4-chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) hoặc p-chlorophenoxyacetic acid (PCPA), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid
(2,4,5-T), 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA), 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (picloram), và 3,6-dichloro-2methoxybenzoic acid (dicamba).

Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn. Nói chung, các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng.
Mặc dù, những chi tiết ở mức độ phân tử về hoạt động của auxin vẫn chưa được biết nhiều, nhưng một số nghiên cứu về di truyền và phân tử đã cung cấp những kết quả mới thú vị. Trong những năm qua, một số gen mã hóa cho các protein liên kết auxin (auxin binding proteins) đã được tạo dòng (cloning) và khảo sát các đặc điểm của chúng, và thông tin mới về gen cảm ứng auxin (auxin-induced gene) cũng đã thu được. Auxin có tác dụng hoạt hóa các ion H+ trực tiếp hoặc gián tiếp (thông qua sự ảnh hưởng lên các enzyme) làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính giản nỡ của tế bào trong phản ứng với áp suất trương.

Auxin cũng có ảnh hưởng ở mức độ biểu hiện gen và kích thích quá trình tạo rễ. Các auxin có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp, thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo rễ,…

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

• Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu
• Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy
• Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy
• Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh
• Đặc tính của auxin: Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Auxin có khả năng

khởi đầu sự phân chia tế bào.. Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, long (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn.

Nói chung các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng (Razdan 1994)
Các auxin liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy mô, auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indolebutiric axid), IAA (3- indole acetic axid), NAA (Napthaleneaxetic axid), 2,4-D (2,4-D-Dichlorophenoxyaxetic axid) và 2,4,5-T(Trichlorophenoxyacetic axid).

Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi. 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối với môi trường tạo và phát triển callus. Auxin thường hòa tan trong etanol hoặc NaOH pha loãng.

Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin được khái quát dưới đây:

– Kích thích phân chia và kéo dài tế bào

– Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên. Ưu thế chồi đỉnh làm ức chế sinh trưởng của chồi nách. Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ dẫn đến sự phát chồi nách. Nếu thay thế vai trò của chồ đỉnh (đã bị ngắt bỏ) bằng một lớp chất keo có chứa IAA thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng. Cơ chế ức chế của chồi đỉnh liên quan đến một chất điều hoà sinh trưởng khác là ethylene. Auxin (IAA) kích thích

chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh.

– IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn (xylem and phloem).

– Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ trong nuôi cấy mô.

– Auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường.

– Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus)

– Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp)

– Tạo phôi soma (2,4-D)

b. Nhóm các cytokinin

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6- benzylaminopurine (BAP) hoặc 6benzyladenin (BA), 6-γ-γdimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin). Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Nói chung, chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng.
Một số hợp chất được phát hiện trong thời gian gần đây có hoạt tính giống cytokinin là N,N’-diphenylurea (DPU), thidiaziron, N-2-chloro-4-puridyl-N-phenyl urea (CPPU) và một số dẫn xuất khác của diphenyl urea. Hiệu quả đặc biệt của các hợp chất gốc urea lên sự sinh trưởng của mô thực vật cần phải được nghiên cứu thêm.
Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái (morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách. Vấn đề quan trọng không kém là nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng này. Chẳng hạn 2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành callus ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả 2 trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1. Cơ chế hoạt động của cytokinin là chưa được biết rõ ràng mặc dù có một số kết quả về sự có mặt của các hợp chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận chuyển (transfer RNA). Các cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợp RNA, tăng hoạt tính enzyme và protein trong các mô nhất định.

– Kinetin được phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mới sau khi khử trùng ở nhiệt độ cao hay đun sôi. Trong cơ thể sống không có kinetin tồn tại, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân chia tế bào (do đó có tên là kinetin) ở các mô không phân hóa.
Trong tự nhiên cũng tồn tại một hormone phân bào khác, Letham là người đầu tiên đã phân lập, tinh chế và cho kết tinh thành công hormone phân bào tự nhiên đó từ nội nhũ đang ở dạng sữa của hạt ngô. Hợp chất cytokinin tự nhiên đó được gọi là zeatin (zea: ngô). – Tương tự các cytokinin khác, zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin.
Trong thực tiễn nuôi cấy mô người ta chỉ dùng zeatin trong những trường hợp đặc biệt vì giá thành rất đắt, thường thay thế zeatin bằng kinetin hoặc một sản phẩm tổng hợp nhân tạo khác, đó là: – 6-Benzylaminopurine (BAP): Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác động của nhiệt độ cao. BA có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao đổi chất.
Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v… Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ.

Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau:

– Kích thích phân chia tế bào

– Tạo và nhân callus

– Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

– Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh

– Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào

– Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài

– Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) – Ức chế sự hình thành rễ

– Ức chế sự kéo dài chồi

– Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục c. Gibberellin

Gibberellin được phát hiện vào những năm 1930. Lịch sử phát hiện nhóm hormone này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von. Năm 1926, xác định được bệnh đó là do loài nấm Gibberella fujikuroi gây ra. Đến những năm 30, mới phân lập và tinh chế được hoạt chất, được gọi là gibberellin. Mãi sau chiến tranh thế giới thứ II năm 1950, người Anh và người Mỹ mới biết đến công trình này của người Nhật. Tới nay, người ta đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm gibberellic acid. Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật là GA3.
Trong đời sống thực vật gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi, sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật. Nhưng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật tác dụng của gibberellic acid chưa thật rõ ràng. Nhiều tác giả có sử dụng và coi đó là thành phần không thể thiếu của một loại môi trường chuyên dụng nào đó.
Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA3 là chất được sử dụng nhiều hơn cả trong thực tiễn. GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vô tính. So với auxin và cytokinin, gibberellin hiếm khi được dùng. GA3 có tính hoà tan trong nước.

Gibberellin có các chức năng cơ bản sau:

– Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, các phôi non, tế bào đầu rễ, quả non, hạt chưa chín hoặc

đang nảy mầm đều có chứa nhiều gibberellic axit.

– Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ kéo dài thân và đòng lúa sau